pri-miR-146a單核苷酸多肽性降低miR-146a表達及與阿爾茨海默病發(fā)病相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　關(guān)于阿爾茨海默病發(fā)病原因有多種假設，其中最經(jīng)典的假設為阿爾茨海默病是由一個Aβ42異常的淀粉樣蛋白的沉積造成的，而淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein，APP)異常也會加快該疾病的進展。阿爾茨海默病神經(jīng)方面的病理變化是由神經(jīng)元和突觸的損傷所造成的，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維呈纏結(jié)排列，細胞外出現(xiàn)淀粉樣斑塊。
　　最近，越來越多的研究表明，神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡失調(diào)也是AD發(fā)病的機制之一。身體的免疫系

2、統(tǒng)炎癥與阿爾茨海默病密切相關(guān)，而先天性免疫系統(tǒng)對腦代謝、神經(jīng)保護和修復等方面是至關(guān)重要的。一旦免疫系統(tǒng)和炎癥信號途徑被激活，機體就會產(chǎn)生過量的氧自由基，其次促炎性細胞因子以及前列腺素也會大量表達，進而引發(fā)炎癥級聯(lián)反應，從而導致神經(jīng)退行性疾病和阿爾茨海默病的發(fā)生和進展?；谝陨显?，關(guān)于阿爾茨海默病的發(fā)病機理目前仍然需要更深入的研究。
　　microRNAs(微小RNA，miRNAs)是一種長度為21-25個核苷酸、成熟的內(nèi)源性、非

3、編碼的單鏈小分子并具有高度保守的RNAs，它主要在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，通過靶向3'端未翻譯區(qū)域，干擾靶mRNA切割或抑制翻譯來調(diào)控基因的表達。已經(jīng)有研究證實，miRNA參與了不同的生物學進程，在多種人類疾病中發(fā)揮作用并參與幾乎所有的生物學進程，包括疾病的發(fā)展、細胞分化、增殖與死亡。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后都有密切聯(lián)系。
　　目前，有學者認為出現(xiàn)在miRNA或其結(jié)合部位的單核苷酸多態(tài)性(single

4、nucleotide polymorphisms，SNPs)是導致miRNA遺傳變異的的異常源頭，從而導致癌癥等疾病易感性的差別。研究者認為，基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1％，這種基因組的單個位點上的堿基的差異稱為SNPs，它是存在于人群中每個個體的基因序列細微差別，在整個人類基因組中分布相當廣泛，其具有的生物學功能，可以通過影響成熟miRNA的二級結(jié)構(gòu)、表達水平及其與靶基因的識別，使mi

5、RNA的調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)生異常，進而與癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　研究提示miRNA可能在阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。目前，研究報道在阿爾茨海默病患者的血液中發(fā)現(xiàn)多種miRNA的異常表達，其中包括miR-137，miR-181c，miR-9，miR-16和miR-29a/b等。進一步的研究表明，miR-146參與到炎癥信號的上調(diào)過程中，而炎癥信號的上調(diào)與朊病毒誘導的神經(jīng)退行性變、類風濕及顳葉癲癇病有很大的相關(guān)性。另

6、外，在阿爾茨海默病患者的腦組織中，發(fā)現(xiàn)miR-146的異常表達，這就提示異常的miR-146表達可能是導致阿爾茨海默病患者炎性老年斑病變形成的重要因素。同時研究者也發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病病人腦組織及五個不同的阿爾茨海默病動物模型中，miR-146a呈現(xiàn)異常表達的現(xiàn)象，其次在阿爾茨海默病的解剖神經(jīng)病理組織中，也同樣發(fā)現(xiàn)了miRNA-146a的異常表達，這些均提示miR-146a可能在阿爾茨海默病中發(fā)揮重要的作用。但是由于上述研究存在樣本量少

7、的現(xiàn)象，因此亟需大量的廣泛的研究以明確miRNA-146a與阿爾茨海默病的相關(guān)性。
　　在本研究中，我們對103例阿爾茨海默病患者進行pri-miR-146a基因組DNA的序列分析，雖然沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因組系列的變化，但是我們發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病患者中存在pri-miR-146a的核苷酸多態(tài)性。進一步通過qRT-PCR分析，我們發(fā)現(xiàn)C等位基因能夠明顯降低成熟的miR-146a的表達。重要的是，miR-146a表達的降低又進一步導致

8、抑制性靶基因TLR2的高表達，而TLR2能夠促進小神經(jīng)膠質(zhì)細胞的炎性反應，從而進一步導致阿爾茨海默病的發(fā)生。
　　方法：
　　1.血液標本的收集
　　本病例組選取作者所在醫(yī)院的103例AD病例為研究對象，同時以206例健康志愿者為正常的研究對照。所有患者均為無血緣關(guān)系的獨立的漢族人群。
　　正常對照組從醫(yī)院的健康檢查中心隨機選取，無明顯的臨床癥狀。按年齡匹配相應的對照，抽取兩者外周血。研究對象必須簽署知情同意書，

9、并提供相關(guān)的完整的流行病學調(diào)查。
　　2.細胞培養(yǎng)實驗
　　對HEK293T及RAW264.7細胞在含有10％肽牛血清、100 IU/ml的青霉素及10 mg/mL鏈霉素的DMED培養(yǎng)基中按照常規(guī)培養(yǎng)方案，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。
　　3.RNA的提取與miR-146a的檢測實驗
　　用TRIzol分別提取樣本中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，運用QuantitiveRT-PCR測出樣本中成熟的miR-

10、146a與miR-146a前體的含量。
　　4.載體構(gòu)建
　　PCR獲得各突變體的片斷，膠回收各突變體的片斷，酶切回收片段與載體，將片段與載體進行連接反應后，轉(zhuǎn)化挑克隆，進行PCR及酶切鑒定。
　　5.miR-146a的瞬時轉(zhuǎn)染實驗
　　選miR-146a表達水平低的HEK293T細胞作轉(zhuǎn)染實驗，HEK293T接種于12孔板中，用miR-146a mimic及miR-146a mimicNC對HEK293T細胞進

11、行轉(zhuǎn)染，然后分析轉(zhuǎn)染后miR-146a對HEK293T細胞產(chǎn)生的相對應的影響。
　　6.雙熒光酶活性分析
　　HEK293T接種于48孔板中，采用lipo2000將熒光素酶報告基因與miR-146a模擬物及抑制物共同進行轉(zhuǎn)染，2天之后對轉(zhuǎn)染細胞進行收取，采用雙熒光素報告基因系統(tǒng)檢測基因的表達。每個實驗需要重復三次。結(jié)果表示為相對熒光素酶活性。
　　7.Western blotting
　　通過瓊脂糖凝膠電泳對蛋白

12、進行分離，然后將瓊脂糖凝膠的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，膜經(jīng)過單克隆抗體孵育后，特異性蛋白復合物再與辣根過氧化物酶偶聯(lián)后，暗室曝光顯影，即為所分析蛋白的表達水平。
　　8.ELISA
　　采用ELISA試劑盒檢測TNF-α的分泌水平。
　　9.統(tǒng)計學分析
　　數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行，進行研究數(shù)據(jù)的精確分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采取t檢驗比較兩組間的差異，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0

13、.05表示差別具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.在阿爾茨海默病患者的外周血中rs2910164中異常C等位基因明顯增加。為了分析pre-miR-146核苷酸多肽性與阿爾茨海默病的相關(guān)性，采用Taqman等位基因鑒別儀，對103例阿爾茨海默病患者與206例配對正常人血液樣本中pre-miR-146a編碼區(qū)核苷酸多肽性進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)103例阿爾茨海默病患者血液樣本與配對的206例正常人血液樣本比較，稀有等位基因C的表達在

14、阿爾茨海默病患者血液樣本中明顯增加。
　　2.異常C等位基因降低體內(nèi)外miR-146a的表達。
　　將不同基因型的pre-miR-146a表達載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，分析成熟的miR-146a的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與rs2910164 G及GC雜合子基因型相比，C基因型降低成熟的miR-146a表達量達到32％。進一步體內(nèi)對阿爾茨海默病患者血清樣本中pri-miR-146a不同基因型對于miR-146a表達的分析發(fā)現(xiàn)，與rs

15、2910164 GG基因型攜帶阿爾茨海默病患者相比，CC基因型攜帶患者mir-146a表達水平明顯降低。
　　3.miR-146a表達的降低導致其抑制性靶基因TLR2的表達上調(diào)。
　　為了驗證TLR2是否是miR-146a的靶基因，將828bp的3'-UTR克隆至含有熒光素酶報告基因的pGL3載體中，形成雙熒光系統(tǒng)的pGL3-TLR2質(zhì)粒，將雙熒光系統(tǒng)的pGL3-TLR2質(zhì)粒與miR-146a、miR-146a模擬物及抑制物

16、共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-146a模擬物及抑制物共同轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中相比，轉(zhuǎn)染miR-146a組熒光強度明顯降低，即miR-146a能夠抑制TLR2的表達，同時也明顯抑制TLR2蛋白的表達。
　　4.RAW264.7細胞在Aβ42的刺激上，pri-miR-146a C基因型能夠上調(diào)TNF-α的分泌。在細胞系水平分析異常等位基因C的功能，通過轉(zhuǎn)染pri-miR-146a不同基因型載體至RAW264