白藜蘆醇對梗阻性黃疸腸黏膜上皮屏障及氧化應激損傷的保護作用研究.pdf

1、梗阻性黃疸(obstructive iaundice,OJ)造成腸黏膜屏障損傷,可引發(fā)各種感染并發(fā)癥,嚴重者導致敗血癥及多臟器功能衰竭。近年來對OJ腸黏膜屏障損傷的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。腸黏膜屏障最重要的結(jié)構(gòu)是腸上皮細胞間的緊密連接(tight junction,TJ),它對維護腸黏膜屏障功能和腸黏膜的通透性起重要作用。TJ是構(gòu)成上皮屏障功能的重要結(jié)構(gòu),也是腸上皮細胞間的主要連接方式,對腸道黏膜通透性起決定性作用,能有效阻止腸

2、腔內(nèi)有害物質(zhì),如毒素或細菌穿過腸黏膜進入體內(nèi)其他組織器官和血液循環(huán),而僅對離子、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)選擇性通過。現(xiàn)已證明,有多種蛋白質(zhì)參與TJ形成,主要有閉鎖蛋白(Occludin)、claudin蛋白、Zos(zonula occludins)蛋白以及連接黏附分子(iunction adhesion molecular,JAM)等。TJ的破壞及其導致的腸黏膜屏障受損使得腸上皮對有害物質(zhì)的通透率增加導致炎癥及黏膜損傷。
　　 梗阻性

3、黃疸伴隨腸黏膜氧化應激反應(oxidative stress),后者可能是導致腸黏膜屏障損傷和通透性增高的一個關(guān)鍵因素。血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)是一種多功能微粒體氧化酶的誘導型,其活性可在多種應激狀態(tài)下被誘導。已經(jīng)證實該酶系氧化應激的主要敏感指標之一,該誘導作用被認為是機體對各種氧化應激刺激的一種適應性保護反應。HO-1降解血紅素產(chǎn)生等摩爾的膽綠素(biliverdin),一氧化碳(carbonmon

4、oxide,CO)和游離鐵(iron),其中膽綠素迅速被膽綠素還原酶還原成膽紅素(bilirubin)。HO-1/CO系統(tǒng)可能參與機體應激狀態(tài)下的細胞保護機制,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中表達增加,對機體起保護作用,有利于減少細胞死亡、蛋白質(zhì)氧化及脂質(zhì)過氧化等。
　　 白藜蘆醇(resveratrol,Res)即反3,4',5-三羥基二苯乙烯,屬于黃酮類化合物,是一種重要的植物抗毒素和抗氧化劑,可以抵御活性氧介質(zhì)對DNA的損傷,并

5、且防止細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應,具有抗炎、抗過敏和抗誘變作用。Res的抗氧化、抗自由基效應對預防和治療因氧化損傷引起的各種紊亂和失調(diào)具有非常重要意義。近年來,越來越多的研究表明Res對許多器官、組織和細胞都具有保護作用,Res作為一種抗氧化劑,具有清除氧自由基抑制NF-κB激活作用。已經(jīng)證實Res是一種天然的HO-1強誘導劑。
　　 因此,本研究重點探討了Res對梗阻性黃疸腸黏膜上皮屏障及氧化應激保護作用及其機制。實驗內(nèi)容主要包

6、括以下4部分:
　　 第一部分:惡性梗阻性黃疸患者小腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白表達變化及意義
　　 目的:探討惡性梗阻性黃疸(malignant obstructive jaundice,MOJ)患者小腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白表達變化及意義。
　　 方法:收集行內(nèi)鏡逆行胰膽管造影(ERCP)檢查或治療的惡性膽道梗阻伴黃疸患者15例;惡性膽道梗阻無黃疸患者10例;并以胃鏡檢查健康體檢者10例作為對照組。取十二指腸

7、乳頭以下2-5cm范圍內(nèi)腸黏膜組織觀察其形態(tài)學改變,應用免疫組織化學和western blot方法檢測MOJ患者腸黏膜緊密連接蛋白Occludin、ZO-1分布及表達的變化。
　　 結(jié)論:MOJ伴黃疸患者小腸黏膜上皮細胞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達減少,這可能是MOJ患者腸黏膜屏障損傷、通透性增加的重要原因。
　　 第二部分:惡性梗阻性黃疸患者腸黏膜氧化應激損傷中血紅素加氧酶-1表達增加
　　 目的

8、:探討血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)在惡性梗阻性黃疸(malignant obstructive jaundice,MOJ)患者小腸黏膜表達及其在氧化應激損傷中的作用。
　　 方法:采用前瞻性研究,收集行ERCP檢查或治療的惡性膽道梗阻伴黃疸患者15例;惡性膽道梗阻無黃疸患者10例;并以胃鏡檢查健康體檢者10例作為對照組。取十二指腸乳頭以下2-5cm范圍內(nèi)腸黏膜組織,應用比色法檢測組織丙二醛(ma

9、londialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,原位缺口末端標記法(TdT-mediateddUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法檢測細胞凋亡。應用免疫組織化學和western blot方法檢測MOJ患者小腸黏膜HO-1分布及表達的變化。
　　 結(jié)論:MOJ患者小腸上皮細胞存在氧化應激損傷,同時隨著膽道梗阻的不斷進展HO-1蛋白

10、表達明顯升高,這可能是減輕腸黏膜損傷的一種保護性反應。
　　 第三部分:白藜蘆醇對實驗性梗阻性黃疸大鼠腸黏膜上皮屏障及氧化應激保護作用
　　 目的:探討白藜蘆醇(resveratrol,Res)對梗阻性黃疸(obstructivejaundice,OJ)大鼠腸黏膜上皮屏障及氧化應激的保護作用。
　　 方法:建立OJ大鼠動物模型,將60只Wistar大鼠隨機分為5組,假手術(shù)組(sham operation,so),

11、膽總管結(jié)扎組(bile duct ligated,BDL),膽總管結(jié)扎+溶劑組(BDL+vehicle),膽總管結(jié)扎+Res干預組,分別設10 mg/kg和20mg/kg兩個濃度組,于1 wk、2 wk兩個時間點取材。取末端回腸黏膜組織觀察其形態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)改變,采用鱟試劑終點顯色法檢測血漿內(nèi)毒素(endotoxin,ET)含量,應用比色法檢測組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide

12、 dismutase,SOD)活性,原位缺口末端標記法(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)檢測細胞凋亡。應用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem massspectrometry,LC-MS/MS)測定大鼠尿樣乳果糖(lactulose)/甘露醇(mannitol)比值(L/MLL值)。應用免疫組織化學和western blot方法

13、檢測末端回腸黏膜HO-1及緊密連接蛋白ZO-1、Occludin分布和表達,real time PCR方法檢測HO-1 mRNA水平。
　　 結(jié)論:梗阻性黃疸大鼠存在高內(nèi)毒素血癥、小腸黏膜的氧化應激損傷,腸黏膜細胞凋亡增加,通透性增加,小腸黏膜上皮ZO-1,Occludin分布紊亂,表達下降,小腸黏膜上皮屏障的完整性破壞,HO-1蛋白表達及基因水平升高,Res可能通過誘導HO-1的蛋白和基因表達來保護腸黏膜上皮屏障及氧化應激損傷

14、。
　　 第四部分:白藜蘆醇對腸單層上皮氧化應激損傷的保護作用
　　 目的:白藜蘆醇對H2O2介導的腸單層上皮氧化應激損傷的保護作用。
　　 方法:建立Caco-2單層細胞模型,用H2O2模擬OJ腸黏膜氧化應激狀態(tài)。實驗分為DMSO組,H2O2(500μM)組,H2O2+不同濃度Res組(1,10,20μM),H2O2+Res(20μM)+Znpp(HO-1特異性抑制劑,20μM)組,共同孵育1 h、3 h、6

15、h后,收集細胞培養(yǎng)液檢測乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD);測量腸單層上皮的跨上皮細胞電阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)和熒光素鈉透過率:Western blot和免疫熒光化學方法檢測ZO-1和Occludin在腸單層上皮的表達及