基于5-羥色胺信號(hào)系統(tǒng)的戊己丸不同配伍方改善結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的機(jī)制研究.pdf

1、1、研究目的：
　　 腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是臨床上常見(jiàn)的消化道疾病，發(fā)病率高，影響患者生活和工作。部分患者是在急性胃腸道感染后出現(xiàn)臨床癥狀，被稱為炎癥后腸易激綜合征(Post inflammation Irritable Bowel Syndrome，PI-IBS)。發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未闡明，但腦-腸軸的調(diào)節(jié)功能起著非常重要的作用。5-羥色胺（5-hydroxytryptamin

2、e，5-HT）是一種廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的腦腸肽，參與腦-腸軸功能的調(diào)節(jié)，在炎癥后腸易激綜合征的發(fā)病中起著至關(guān)重要的作用。戊己丸由黃連、制吳茱萸和土炒白芍組成，具有疏肝理脾，清熱和胃的作用，臨床上常用來(lái)治療腸易激綜合征。本實(shí)驗(yàn)以戊己丸的兩個(gè)配伍方為治療藥物，采用乙酸灌腸致炎和束縛應(yīng)激法建立炎癥后腸易激綜合征大鼠模型，從結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能和中樞邊緣系統(tǒng)和結(jié)腸中5-HT信號(hào)系統(tǒng)功能的角度，進(jìn)行整體藥效和機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究及大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞

3、的實(shí)驗(yàn)，探索戊己丸改善炎癥后腸易激綜合征結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的藥理作用及機(jī)制，并觀察戊己丸兩種配伍比例下在藥效及作用機(jī)制中的異同，為中醫(yī)藥的配伍理論及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果：
　　 2.1 PI-IBS大鼠模型的建立
　　 方法:采用大鼠結(jié)腸內(nèi)灌注40 mL·L-1的乙酸1mL，致急性結(jié)腸炎癥，恢復(fù)7天后分別施加束縛應(yīng)激或寒冷制動(dòng)應(yīng)激造成大鼠PI-IBS模型。通過(guò)比較兩種模型大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能及血清、結(jié)

4、腸、脊髓和腦中5-HT的含量，結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)目和脫顆粒率，選出一種適合進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需求的大鼠模型。
　　 結(jié)果:兩模型組中大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)明顯加快，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;血清、結(jié)腸和脊髓中5-HT含量顯著升高，而腦中則呈下降趨勢(shì)，且乙酸加束縛應(yīng)激組下降更為顯著;肥大細(xì)胞數(shù)目雖有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)意義，肥大細(xì)胞脫顆粒率均顯著升高，且以寒冷制動(dòng)組更為顯著。
　　 結(jié)論:乙酸加束縛應(yīng)激法建立的PI-IBS模型大鼠腦內(nèi)5-HT水平下降更顯

5、著，此模型用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.2戊己丸不同配伍方對(duì)PI-IBS結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的藥效學(xué)研究
　　 方法:PI-IBS大鼠模型采用乙酸灌腸加束縛應(yīng)激法建立，在應(yīng)激后，各治療組分別給予得舒特和相應(yīng)劑量的戊己丸不同配伍方，模型組和正常對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，給藥7天。分別檢測(cè)建模前、應(yīng)激后及治療后的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能，以結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)和運(yùn)動(dòng)指數(shù)變化率、2h內(nèi)的排便粒數(shù)及玻璃小球排出時(shí)間作為觀察指標(biāo)。
　　 結(jié)果:

6、　　 (1)各組大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)及運(yùn)動(dòng)指數(shù)變化率的變化
　　 應(yīng)激后，各建模組大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)顯著加快，差異非常顯著(P＜0.01）;戊己丸1號(hào)方和2號(hào)方可使模型大鼠結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)和結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)變化率均有所降低，中高劑量組差異顯著(P＜0.01）;兩配伍方高劑量組結(jié)腸運(yùn)動(dòng)指數(shù)及2號(hào)方高劑量組運(yùn)動(dòng)指數(shù)變化率與PC組水平相當(dāng);兩配伍方的3個(gè)劑量組之間亦有明顯差異，但同劑量組之間并無(wú)差異。
　　 (2)各組大鼠玻璃小球排出時(shí)間比較

7、
　　 建模前，各組大鼠玻璃小球排出時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;應(yīng)激后，各建模組大鼠玻璃小球排出時(shí)間明顯縮短，與正常組比較差異顯著（P＜0.01）;戊己丸1號(hào)方和2號(hào)方可使模型大鼠玻璃小球排出時(shí)間有不同程度的延長(zhǎng)，1號(hào)方和2號(hào)方中、高劑量組差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。兩配伍方的高劑量組與PC組時(shí)間相當(dāng)。兩個(gè)配伍方的低、中劑量組與高劑量組有非常顯著差異(P＜0.01);同劑量組間無(wú)差異。
　　 (3)各組大鼠2h內(nèi)糞粒數(shù)

8、比較
　　 建模前，各組大鼠2h內(nèi)排出的糞粒數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;應(yīng)激后，各建模組大鼠的糞粒數(shù)較正常組顯著增多(P＜0.01);戊己丸兩配伍方均可不同程度的減少模型大鼠排出的糞粒數(shù)，兩方的高劑量組差異顯著（P＜0.05，P＜0.01）;中、高劑量組與PC組無(wú)差異;2號(hào)方低、高劑量組間有極顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.3戊己丸不同配伍方對(duì)PI-IBS結(jié)腸運(yùn)動(dòng)的作用機(jī)制研究
　　 方法:治療7天后，各組大鼠腹腔麻醉

9、，腹主動(dòng)脈取血，以HPLC-ECD檢測(cè)血清中5-HT和5-HIAA的含量。同時(shí)取結(jié)腸及海馬、下丘腦和額葉，以HPLC-ECD檢測(cè)5-HT和5-HIAA的含量;并行5-HT免疫組化染色，并用Image Pro Plus分析軟件對(duì)免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)OD值，進(jìn)行半定量分析。采用免疫熒光染色法，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)腸和海馬中5-HT3,4受體的熒光強(qiáng)度;用ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)腸和海馬中腺苷酸環(huán)化酶、磷酸二酯酶4和鈣離子濃度;應(yīng)用Western

10、 Blotting檢測(cè)結(jié)腸中cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白磷酸化水平。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。
　　 結(jié)果:
　　 (1)戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠血清中5-HT和5-H轉(zhuǎn)化率的影響
　　 模型組大鼠血清中5-HT含量有所增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)差異;5-HIAA含量、5-HT轉(zhuǎn)化率均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);1號(hào)方高劑量可顯著降低血清5-HT含量(#P＜0.05);1號(hào)方中、高劑量可明顯升高5-HIA

11、A的含量(P＜0.05，P＜0.01);除W2-L組外，戊己丸各組可使5-HT轉(zhuǎn)化率有不同程度的提高，差異顯著(P＜0.05，P＜0.01);2號(hào)方高劑量組在升高5-HIAA含量及中、高劑量組提高5-HT轉(zhuǎn)化率的作用優(yōu)于同劑量1號(hào)方。
　　 (2)戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠結(jié)腸中5-HT和5-HT轉(zhuǎn)化率的影響
　　 模型大鼠結(jié)腸中5-HT和5-HIAA含量顯著增高(P＜0.01)，而5-HT轉(zhuǎn)化率有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)差異;戊

12、己丸不同配伍方可使5-HT含量顯著下降，中、高劑量可使5-HIAA的含量明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，藥效與劑量成正比;5-HT轉(zhuǎn)化率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;兩配伍方的高劑量降低5-HT含量的作用優(yōu)于得舒特;兩方之間無(wú)差異。
　　 (3)戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠結(jié)腸中5-HT表達(dá)的影響
　　 M組大鼠結(jié)腸粘膜下神經(jīng)叢和肌間神經(jīng)叢5-HT陽(yáng)性神經(jīng)表達(dá)顯著增高(P＜0.01);戊己丸能使其明顯下降(P＜0.01)，作用效果與劑

13、量成正比;兩方同劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。
　　 (4)戊己丸不同配伍方對(duì)PI-IBS大鼠結(jié)腸5-HT3R，5-HT4R的影響
　　 模型大鼠結(jié)腸肌層5-HT3R和5-HT4R的熒光強(qiáng)度顯著上調(diào)(P＜0.01);兩個(gè)配伍方均可使其明顯下調(diào)(P＜0.01)，且作用效果與劑量成正相關(guān);1號(hào)方中、高劑量下調(diào)5-HT3R的作用及低劑量降低5-HT4R的效果優(yōu)于2號(hào)方同劑量(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (5)戊己丸不同

14、配伍方對(duì)PI-IBS大鼠結(jié)腸Ca2+，AC，PDE4的影響
　　 模型大鼠結(jié)腸Ca2+，AC的含量顯著升高，PDE4則明顯下降(P＜0.01);1號(hào)方和2號(hào)方均可顯著下調(diào)Ca2+，AC，并上調(diào)PDE4（P＜0.05，P＜0.01）;2號(hào)方中、高劑量組對(duì)Ca+，AC的下調(diào)作用與PC相當(dāng);但升高PDE4的作用優(yōu)于得舒特(P＜0.01);2號(hào)方下調(diào)Ca+，AC及低劑量上調(diào)PDE4的作用優(yōu)于同劑量1號(hào)方。
　　 (6)戊己丸不同

15、配伍方對(duì)PI-IBS大鼠結(jié)腸CREB磷酸化的影響
　　 各組CREB的表達(dá)無(wú)差異，但M組大鼠CREB蛋白磷酸化水平顯著增高(P＜0.01);除1號(hào)方低劑量外，各劑量均可明顯使其下調(diào)(P＜0.05，P＜0.01);兩方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (7)各組大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)目和脫顆粒率的變化
　　 M組大鼠結(jié)腸肥大細(xì)胞數(shù)目和脫顆粒率均明顯升高(P＜0.01);戊己丸各劑量均可使其顯著下降(P＜0.01)，作用效果與劑

16、量正相關(guān);兩方的高劑量組肥大細(xì)胞數(shù)目及1號(hào)方高劑量組脫顆粒率與PC組相當(dāng);兩方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (8)各組大鼠結(jié)腸黏膜嗜鉻細(xì)胞數(shù)目的變化
　　 M組中大鼠結(jié)腸黏膜嗜鉻細(xì)胞數(shù)目較NC組顯著增多(P＜0.01);戊己丸可使其明顯下降(P＜0.01)，藥效與劑量成正比;兩方的高劑量下調(diào)作用優(yōu)于得舒特(P＜0.05);兩方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (9)各組大鼠海馬中5-HT及5-HT轉(zhuǎn)化率的變化
　　

17、與NC組比較，模型組中大鼠海馬中5-HT含量明顯降低，5-HIAA含量和5-HT轉(zhuǎn)化率顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)。除1號(hào)方低劑量外，戊己丸各劑量均可顯著上調(diào)5-HT含量;兩配伍方的高劑量可明顯下調(diào)5-HIAA的含量;除2號(hào)方低劑量外均可明顯降低5-HT轉(zhuǎn)化率(P＜0.05，P＜0.01)，作用效果與劑量成正比。兩配伍方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (10)各組大鼠下丘腦中5-HT及5-HT轉(zhuǎn)化率的變化
　　 與N

18、C組比較，模型組中大鼠下丘腦中5-HT和5-HIAA含量明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，5-HT轉(zhuǎn)化率則顯著升高(P＜0.01)。除1號(hào)方低劑量外，戊己丸各劑量均可顯著上調(diào)5-HT含量和下調(diào)5-HT轉(zhuǎn)化率;兩配伍方的中劑量可明顯上調(diào)5-HIAA的含量(P＜0.05，P＜0.01)。1號(hào)方的高劑量升高5-HT含量的作用優(yōu)于得舒特，兩配伍方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (11)各組大鼠額葉中5-HT及5-HT轉(zhuǎn)化率的變化

19、　　 與NC組比較，模型組中大鼠額葉中5-HT含量較正常組明顯降低(P＜0.01)，5-HIAA含量和5-HT轉(zhuǎn)化率則明顯升高(P＜0.01)。戊己丸的中、高劑量可顯著升高5-HT含量及降低5-HT轉(zhuǎn)化率;各劑量均可明顯下調(diào)5-HIAA的含量(P＜0.05，P＜0.01)。兩配伍方同劑量組間無(wú)差異。
　　 (12)下丘腦、額葉及海馬中5-HT陽(yáng)性表達(dá)
　　 M組的大鼠海馬、下丘腦中5-HT陽(yáng)性表達(dá)量較NC組顯著下降，而

20、額葉中則明顯升高(P＜0.01);戊己丸可明顯上調(diào)海馬、下丘腦中5-HT表達(dá)，除1號(hào)方低劑量外均可顯著下調(diào)額葉中表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，藥效與劑量正相關(guān);兩配伍方的中、高劑量組在海馬中的作用，除1號(hào)方低劑量外在下丘腦中的上調(diào)作用及1號(hào)方的高劑量組和2號(hào)方中、高劑量在額葉中的下調(diào)作用均優(yōu)于得舒特(P＜0.05，P＜0.01);2號(hào)方的高劑量上調(diào)下丘腦中5-HT表達(dá)量及中、高劑量組降低額葉中5-HT表達(dá)量的作用優(yōu)于同劑量1號(hào)方(

21、P＜0.05，P＜0.01)。
　　 (13)戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠海馬中5-HT3R，5-HT4R的影響
　　 M組大鼠5-HT3R和5-HT4R的表達(dá)量較NC組均顯著下降(P＜0.01);戊己丸可使其明顯上調(diào)(P＜0.01)，作用效果與劑量成正比;1號(hào)方的高劑量、2號(hào)方中、高劑量上調(diào)5-HT3R和5-HT4R的作用優(yōu)于得舒特(P＜0.05，P＜0.01);2號(hào)方低、中劑量對(duì)5-HT3R及中、高劑量對(duì)5-HT4R的上調(diào)

22、作用強(qiáng)于同劑量水平的1號(hào)方（P＜0.05，P＜0.01）。
　　 (14)戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠海馬中AC，PDE4，Ca2+濃度的影響
　　 與NC組比較，M組海馬中鈣離子濃度和PDE4含量明顯升高，AC活性顯著降低(P＜0.01);戊己丸可顯著下調(diào)鈣離子和PDE4及上調(diào)AC活性(P＜0.05，P＜0.01)，作用效果與劑量正相關(guān);1號(hào)方低、高劑量降低鈣離子的作用優(yōu)于同劑量2號(hào)方，1號(hào)方的高劑量對(duì)AC，PDE4的作用優(yōu)

23、于2號(hào)方的高劑量(P＜0.05)。
　　 2.4戊己丸不同配伍方對(duì)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞5-HT3,4受體及下游信號(hào)通路的影響
　　 方法:采用Bitar的方法分離培養(yǎng)大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞，并用α-actin免疫組化法進(jìn)行鑒定，應(yīng)用第二代平滑肌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用免疫熒光法和鈣離子探針檢測(cè)戊己丸對(duì)5-HT3R、5-HT4R的激動(dòng)劑和抑制劑引起的平滑肌細(xì)胞膜上3、4受體表達(dá)及胞內(nèi)鈣離子濃度的影響;應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)戊己丸對(duì)5

24、-HT4R的激動(dòng)劑和抑制劑、AC激動(dòng)劑和抑制劑引起的cAMP、PKA的影響。
　　 結(jié)果:
　　 (1)1號(hào)方和2號(hào)方對(duì)正常大鼠結(jié)腸平滑肌細(xì)胞5-HT3,4受體的表達(dá)及Ca2+濃度均具有抑制作用，能顯著拮抗苯基雙胍和替加色羅引起的3、4受體熒光強(qiáng)度和胞內(nèi)Ca2+升高，亦能明顯促進(jìn)阿洛司瓊和GR113808引起的3、4受體表達(dá)和胞內(nèi)Ca+下降，2號(hào)方的作用效果優(yōu)于1號(hào)方。
　　 (2)戊己丸1號(hào)方和2號(hào)方可顯著下調(diào)

25、正常平滑肌細(xì)胞的cAMP和PKA水平，也可明顯抑制替加色羅和Forskolin引起的cAMP和PKA升高，并可促進(jìn)GR113808和SQ22536引起的cAMP和PKA降低，且2號(hào)方作用優(yōu)于1號(hào)方。
　　 3、結(jié)論：
　　 戊己丸不同配伍方對(duì)炎癥后腸易激綜合征的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)有明確的改善作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)腦-腸軸的雙向調(diào)節(jié)作用，影響結(jié)腸和腦中5-HT、5-HT3R、5-HT4R、cAMP、PKA、Ca2+及結(jié)腸中CRE