Wnt5a激活CDK5參與神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)元細胞周期退出.pdf

1、目的：
　　在神經(jīng)發(fā)育過程中，細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases,CDKs）的調控參與神經(jīng)元細胞周期調控，并激活特定的分化程序。大量證據(jù)表明，CDK5活性的上調是神經(jīng)發(fā)育過程中的核心事件，但其調控機制尚不清楚。Wnt信號通路在細胞發(fā)育過程中具有重要的調控作用，但在神經(jīng)發(fā)育過程中，Wnt信號通路途徑是否參與CDK5活性的激活，進而調控神經(jīng)元細胞周期的退出，尚無研究報道。本研究中探究了在神經(jīng)發(fā)育過

2、程中經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt信號通路在CDKs及神經(jīng)元細胞周期的調控中的作用機制。
　　方法：
　?。?）獲取大鼠不同胚胎發(fā)育時期（E12.5，E14.5，E16.5，E18.5，P0）的大腦皮層組織；
　?。?）應用維甲酸/腦源性神經(jīng)因子（RA/BDNF）聯(lián)合誘導構建神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞分化模型；
　　（3）實時定量RT-PCR(qRT-PCR)方法檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質組織及RA/BDNF聯(lián)合

3、誘導分化前后SH-SY5Y細胞中經(jīng)典Wnt途徑（wnt-1， wnt-3a）和非經(jīng)典Wnt途徑（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的mRNA表達量；并同時檢測上述樣品中重要與細胞周期相關的CDKs（CDK2，CDK4，CDK6）及其對性的細胞周期素（Cyclin D，Cyclin E）以及CDK5和其伴侶分子p35的mRNA表達量；
　　（4）Western Blot法檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質組織及RA/BDNF聯(lián)合

4、誘導分化前后SH-SY5Y細胞中CDK5及p35的蛋白表達情況；
　?。?）體外激酶反應（in vitro Kinase assay）檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質組織及RA/BDNF聯(lián)合誘導分化前后SH-SY5Y細胞中CDK5的激酶活性；
　?。?）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）定量檢測RA/BDNF聯(lián)合誘導分化前后SH-SY5Y細胞培養(yǎng)上清中Wnts的分泌情況；
　?。?）應用wnt蛋白（wnt-3a，wnt-4

5、，wnt-5a，wnt-11）刺激原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元，應用體外激酶反應檢測對CDK5的激酶活性的影響；應用qRT-PCR及Western Blot分別檢測wnt-5a刺激原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中CDK5和p35的mRNA及蛋白表達情況，并應用體外激酶反應檢測CDK5激酶活性；
　?。?）在RA/BDNF聯(lián)合誘導SH-SY5Y細胞分化模型，應用細胞免疫熒光分別標記MAP2（標記成熟神經(jīng)元）及BrdU（標記分裂期細胞），檢測應

6、用wnt-5a中和抗體及wnt-5a抑制劑Box5對RA/BDNF誘導SH-SY5Y細胞分化作用的影響。
　　結果：
　?。?）在大鼠胚胎發(fā)育的大腦皮質組織中，經(jīng)典途徑的wnt（wnt-1，wnt-3a）則減少，而非經(jīng)典途徑的wnt信號（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的表達量增高，；RA/BDNF聯(lián)合誘導分化后SH-SY5Y細胞中經(jīng)典途徑的wnt（wnt-1，wnt-3a）表達量降低，而非經(jīng)典途徑的wnt信號（wn

7、t-4，wnt-5a，wnt-11）的表達量和分泌量增高；
　?。?）在大鼠胚胎發(fā)育的大腦皮質組織及RA/BDNF聯(lián)合誘導分化的SH-SY5Y細胞中，CDKs的表達量無明顯變化，但CyclinD的表達下降，而p35的mRNA和蛋白表達明顯上升，CDK5激酶活性顯著上調；
　?。?）Wnt-5a刺激可顯著上調神經(jīng)元中p35的mRNA和蛋白表達量，并激活CDK5激酶活性，而wnt-3a，wnt-4及wnt-11均無作用；