Wnt5a激活CDK5參與神經(jīng)發(fā)育過程中神經(jīng)元細(xì)胞周期退出.pdf

1、目的：
　　在神經(jīng)發(fā)育過程中，細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases,CDKs）的調(diào)控參與神經(jīng)元細(xì)胞周期調(diào)控，并激活特定的分化程序。大量證據(jù)表明，CDK5活性的上調(diào)是神經(jīng)發(fā)育過程中的核心事件，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Wnt信號通路在細(xì)胞發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用，但在神經(jīng)發(fā)育過程中，Wnt信號通路途徑是否參與CDK5活性的激活，進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞周期的退出，尚無研究報道。本研究中探究了在神經(jīng)發(fā)育過

2、程中經(jīng)典或非經(jīng)典的Wnt信號通路在CDKs及神經(jīng)元細(xì)胞周期的調(diào)控中的作用機(jī)制。
　　方法：
　?。?）獲取大鼠不同胚胎發(fā)育時期（E12.5，E14.5，E16.5，E18.5，P0）的大腦皮層組織；
　　（2）應(yīng)用維甲酸/腦源性神經(jīng)因子（RA/BDNF）聯(lián)合誘導(dǎo)構(gòu)建神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞分化模型；
　?。?）實時定量RT-PCR(qRT-PCR)方法檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質(zhì)組織及RA/BDNF聯(lián)合

3、誘導(dǎo)分化前后SH-SY5Y細(xì)胞中經(jīng)典Wnt途徑（wnt-1， wnt-3a）和非經(jīng)典Wnt途徑（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的mRNA表達(dá)量；并同時檢測上述樣品中重要與細(xì)胞周期相關(guān)的CDKs（CDK2，CDK4，CDK6）及其對性的細(xì)胞周期素（Cyclin D，Cyclin E）以及CDK5和其伴侶分子p35的mRNA表達(dá)量；
　?。?）Western Blot法檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質(zhì)組織及RA/BDNF聯(lián)合

4、誘導(dǎo)分化前后SH-SY5Y細(xì)胞中CDK5及p35的蛋白表達(dá)情況；
　?。?）體外激酶反應(yīng)（in vitro Kinase assay）檢測大鼠不同胚胎發(fā)育時期大腦皮質(zhì)組織及RA/BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)分化前后SH-SY5Y細(xì)胞中CDK5的激酶活性；
　?。?）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）定量檢測RA/BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)分化前后SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)上清中Wnts的分泌情況；
　?。?）應(yīng)用wnt蛋白（wnt-3a，wnt-4

5、，wnt-5a，wnt-11）刺激原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元，應(yīng)用體外激酶反應(yīng)檢測對CDK5的激酶活性的影響；應(yīng)用qRT-PCR及Western Blot分別檢測wnt-5a刺激原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元中CDK5和p35的mRNA及蛋白表達(dá)情況，并應(yīng)用體外激酶反應(yīng)檢測CDK5激酶活性；
　?。?）在RA/BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化模型，應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光分別標(biāo)記MAP2（標(biāo)記成熟神經(jīng)元）及BrdU（標(biāo)記分裂期細(xì)胞），檢測應(yīng)

6、用wnt-5a中和抗體及wnt-5a抑制劑Box5對RA/BDNF誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞分化作用的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）在大鼠胚胎發(fā)育的大腦皮質(zhì)組織中，經(jīng)典途徑的wnt（wnt-1，wnt-3a）則減少，而非經(jīng)典途徑的wnt信號（wnt-4，wnt-5a，wnt-11）的表達(dá)量增高，；RA/BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)分化后SH-SY5Y細(xì)胞中經(jīng)典途徑的wnt（wnt-1，wnt-3a）表達(dá)量降低，而非經(jīng)典途徑的wnt信號（wn

7、t-4，wnt-5a，wnt-11）的表達(dá)量和分泌量增高；
　　（2）在大鼠胚胎發(fā)育的大腦皮質(zhì)組織及RA/BDNF聯(lián)合誘導(dǎo)分化的SH-SY5Y細(xì)胞中，CDKs的表達(dá)量無明顯變化，但CyclinD的表達(dá)下降，而p35的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上升，CDK5激酶活性顯著上調(diào)；
　?。?）Wnt-5a刺激可顯著上調(diào)神經(jīng)元中p35的mRNA和蛋白表達(dá)量，并激活CDK5激酶活性，而wnt-3a，wnt-4及wnt-11均無作用；