脂蛋白結(jié)構(gòu)與功能的透射電子顯微鏡研究.pdf

1、人體血漿中的膽固醇水平是心臟疾病的重要指標。膽固醇在人體中是作為脂蛋白的組成部分參與體內(nèi)循環(huán)輸運的，而其中高密度脂蛋白水平的高低與心血管疾病危險性的大小成反比。相反，血漿中低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和極低密度脂蛋白水平的高低與心血管疾病的危險性大小成正比。明晰不同脂蛋白在心血管疾病中的作用機理，對了解心血管發(fā)病過程及相關(guān)疾病的預(yù)防和治療都十分必要，而其中關(guān)鍵點之一就是要確定脂蛋白的結(jié)構(gòu)—功能關(guān)系。不幸的是，由于脂蛋白自然的高結(jié)構(gòu)活性和動

2、態(tài)性，使得當人們應(yīng)用X射線、核磁共振和質(zhì)譜學(xué)等手段研究脂蛋白結(jié)構(gòu)時遇到了極大的困難。
　　作為研究細胞、病毒和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的良好途徑之一的透射電子顯微鏡，因其可以直觀地觀測分立大分子顆粒的空間結(jié)構(gòu)，就成為了脂蛋白結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的極有潛力的研究工具。但是傳統(tǒng)的脂蛋白負染電鏡樣品制備方法會造成脂蛋白間形成碟串狀聚合物這一假象結(jié)果，影響了電鏡對脂蛋白結(jié)構(gòu)的正常研究。在本文中，我們找到了造成這種假象的原因，并引入了一種可以消除假象的新的負染方法。

3、應(yīng)用該方法，我們研究了脂蛋白主要成員的結(jié)構(gòu)形態(tài)特征。更進一步的，我們揭示了人體中膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白從高密度脂蛋白中向低密度/極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)移膽固醇酯的可能機理。
　　首先，我們研究了自然狀況下含磷脂的載脂蛋白E4的冷凍樣品的電鏡圖像。通過對比多種負染方法和流程的含磷脂載脂蛋白E4顆粒的形狀、尺寸，我們提出了一種最接近于冷凍電鏡結(jié)果的負染方法。統(tǒng)計分析證明該染色方法與冷凍電鏡的結(jié)果所造成的顆粒尺寸差別小于6％且形態(tài)相似；并且得到的圖

4、像具有高襯度和高細節(jié)的特點，因而大大有利于載脂蛋白E4三維結(jié)構(gòu)的研究。通過研究僅含磷脂的脂質(zhì)體，我們發(fā)現(xiàn)含磷脂類物質(zhì)的碟串狀聚合物假象是由傳統(tǒng)負染劑磷鎢酸鈉鹽和溶液的高鹽分引起的。最后我們將該染色方法應(yīng)用到其他主要脂蛋白成員上，所產(chǎn)生的負染電鏡樣品都在電鏡下呈現(xiàn)出分離態(tài)的顆粒，且沒有發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)假象。
　　然后，應(yīng)用這一新的負染方法，我們詳細研究了高密度脂蛋白的主要成員（包括9.6nm盤狀、7.8nm和8.4nm橢球狀、9.3n

5、m球狀重組高密度脂蛋白；人體血漿α、β、pre-β1和pre-β2高密度脂蛋白）、人體低密度脂蛋白、中密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的主要結(jié)構(gòu)形態(tài)特征。所得結(jié)果表明，負染得到的清晰的脂蛋白透射電鏡圖像，以及顯現(xiàn)出的新的結(jié)構(gòu)細節(jié)，為將來應(yīng)用單顆粒分析等方法對脂蛋白的三維結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)提供了良好的基礎(chǔ)。
　　最后，我們研究了人體膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白是如何與脂蛋白相互作用，從而導(dǎo)致膽固醇酯從高密度脂蛋白向低密度/極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)移。通過電鏡研究，