氧化低密度脂蛋白激活樹突狀細胞參與動脈粥樣硬化作用機制的蛋白組學研究.pdf

1、1.研究目的:
　　 盡管動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)病機制目前還不是十分清楚,但是越來越多的證據(jù)表明,動脈粥樣硬化是一種炎癥免疫性疾病。樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是體內(nèi)功能最強大的專職抗原遞呈細胞(antigen-presentingcells,APC),能有效地攝取和處理抗原,并將抗原遞呈給T淋巴細胞,從而激發(fā)免疫應答,并在免疫應答的誘導和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DCs和氧化

2、低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,OX-LDL)是目前公認的致動脈粥樣硬化因素,與AS的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。多種研究表明ox-LDL可以促進DCs的活化和成熟,誘發(fā)一系列的免疫炎癥反應促進AS的發(fā)生和發(fā)展,但其具體機制目前尚不清楚。為了解決這個問題我們應用同位素標記蛋白質(zhì)相對和絕對定量分析(isobarictagging for relative and absolute quantita

3、tion,iTRAQ)的方法檢測DCs被ox-LDL刺激活化前后蛋白表達的變化。
　　 2.研究方法:
　　 (1)、DCs的培養(yǎng)和鑒定:頸椎脫位法處死C57BL／6小鼠,取股骨和脛骨,獲得骨髓來源的單細胞懸液。利用rmGM-CSF和rmlL-4誘導單個核細胞向分化為DCs,培養(yǎng)至第7天收獲細胞備用。
　　 (2)、DCs的干預:DCs培養(yǎng)至第7天,不成熟DCs用10μg／ml ox-LDL刺激24小時。

4、　　 (3)、DCs表型分析:應用流式細胞分析儀,檢測DCs表面成熟標志。
　　 (4)、細胞因子的檢測:2組DCs細胞培養(yǎng)24小時,收集細胞培養(yǎng)上清液,應用ELISA試劑盒檢測白介素-12(Interleukin-12,IL-12)和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factorα,TNF-α)。
　　 (5)、應用iTRAQ技術(shù)檢測2組DCs蛋白表達的差異。
　　 (6)、Western blo

5、t分析:應用Western blot驗證部分差異蛋白的表達。
　　 (7)、建立ApoE基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化模型,檢測組織蛋白酶S及DCs在對照組和瑞舒伐他汀治療組動脈粥樣硬化斑塊中的表達。
　　 3.實驗結(jié)果
　　 (1)、DCs培養(yǎng)7天,空白對照組低表達表面成熟標志CD80,CD86,MHCⅡ和CD40,經(jīng)ox-LDL刺激24活化后這些表面成熟標志高表達。
　　 (2)、2組DCs培養(yǎng)24小時,

6、收集細胞培養(yǎng)上清液用ELIA試劑盒檢測IL-12和TNF-α的表達。實驗結(jié)果表明,ox-LDL的刺激能夠明顯增加細胞因子IL-12和TNF-α的分泌。
　　 (3)、應用iTRAQ檢測2組DCs差異蛋白的表達,我們共檢測到781個蛋白,其中有178個表達增高,有100個表達降低。所檢測到的差異蛋白分別參與細胞免疫反應,脂質(zhì)代謝,氧化應激和細胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)等多個重要的過程。其中多個蛋白與動脈粥樣硬化的發(fā)病有密切的聯(lián)系,如組織蛋白酶類,

7、熱休克蛋白等。其中最有意義的發(fā)現(xiàn)是,ox-LDL能夠使DCs高表達組織蛋白酶S,Z,D和G。
　　 (4)、我們應用Western blot驗證了其中8個表達增高的蛋白,Western blot結(jié)果中的蛋白表達趨勢和iTRAQ實驗結(jié)果一致。
　　 (5)、組織蛋白酶S及DCs在ApoE基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)高表達,瑞舒伐他汀治療能夠明顯減小斑塊面積和降低動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)組織蛋白酶S和DCs在斑塊內(nèi)的表達。