氧化低密度脂蛋白激活樹(shù)突狀細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制的蛋白組學(xué)研究.pdf

1、1.研究目的:
　　 盡管動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的發(fā)病機(jī)制目前還不是十分清楚,但是越來(lái)越多的證據(jù)表明,動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥免疫性疾病。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presentingcells,APC),能有效地?cái)z取和處理抗原,并將抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞,從而激發(fā)免疫應(yīng)答,并在免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。DCs和氧化

2、低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,OX-LDL)是目前公認(rèn)的致動(dòng)脈粥樣硬化因素,與AS的發(fā)病有著密切的聯(lián)系。多種研究表明ox-LDL可以促進(jìn)DCs的活化和成熟,誘發(fā)一系列的免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展,但其具體機(jī)制目前尚不清楚。為了解決這個(gè)問(wèn)題我們應(yīng)用同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)相對(duì)和絕對(duì)定量分析(isobarictagging for relative and absolute quantita

3、tion,iTRAQ)的方法檢測(cè)DCs被ox-LDL刺激活化前后蛋白表達(dá)的變化。
　　 2.研究方法:
　　 (1)、DCs的培養(yǎng)和鑒定:頸椎脫位法處死C57BL／6小鼠,取股骨和脛骨,獲得骨髓來(lái)源的單細(xì)胞懸液。利用rmGM-CSF和rmlL-4誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞向分化為DCs,培養(yǎng)至第7天收獲細(xì)胞備用。
　　 (2)、DCs的干預(yù):DCs培養(yǎng)至第7天,不成熟DCs用10μg／ml ox-LDL刺激24小時(shí)。

4、　　 (3)、DCs表型分析:應(yīng)用流式細(xì)胞分析儀,檢測(cè)DCs表面成熟標(biāo)志。
　　 (4)、細(xì)胞因子的檢測(cè):2組DCs細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,應(yīng)用ELISA試劑盒檢測(cè)白介素-12(Interleukin-12,IL-12)和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factorα,TNF-α)。
　　 (5)、應(yīng)用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)2組DCs蛋白表達(dá)的差異。
　　 (6)、Western blo

5、t分析:應(yīng)用Western blot驗(yàn)證部分差異蛋白的表達(dá)。
　　 (7)、建立ApoE基因敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型,檢測(cè)組織蛋白酶S及DCs在對(duì)照組和瑞舒伐他汀治療組動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 (1)、DCs培養(yǎng)7天,空白對(duì)照組低表達(dá)表面成熟標(biāo)志CD80,CD86,MHCⅡ和CD40,經(jīng)ox-LDL刺激24活化后這些表面成熟標(biāo)志高表達(dá)。
　　 (2)、2組DCs培養(yǎng)24小時(shí),

6、收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液用ELIA試劑盒檢測(cè)IL-12和TNF-α的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ox-LDL的刺激能夠明顯增加細(xì)胞因子IL-12和TNF-α的分泌。
　　 (3)、應(yīng)用iTRAQ檢測(cè)2組DCs差異蛋白的表達(dá),我們共檢測(cè)到781個(gè)蛋白,其中有178個(gè)表達(dá)增高,有100個(gè)表達(dá)降低。所檢測(cè)到的差異蛋白分別參與細(xì)胞免疫反應(yīng),脂質(zhì)代謝,氧化應(yīng)激和細(xì)胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)等多個(gè)重要的過(guò)程。其中多個(gè)蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病有密切的聯(lián)系,如組織蛋白酶類(lèi),

7、熱休克蛋白等。其中最有意義的發(fā)現(xiàn)是,ox-LDL能夠使DCs高表達(dá)組織蛋白酶S,Z,D和G。
　　 (4)、我們應(yīng)用Western blot驗(yàn)證了其中8個(gè)表達(dá)增高的蛋白,Western blot結(jié)果中的蛋白表達(dá)趨勢(shì)和iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　 (5)、組織蛋白酶S及DCs在ApoE基因敲除小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)高表達(dá),瑞舒伐他汀治療能夠明顯減小斑塊面積和降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)組織蛋白酶S和DCs在斑塊內(nèi)的表達(dá)。