預防接種糖基化低密度脂蛋白對糖尿病apo-E---小鼠動脈粥樣硬化的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景：動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是免疫系統(tǒng)功能失調(diào)的慢性炎癥性疾病，也是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。目前動物實驗已經(jīng)證實，AS相關(guān)抗原或肽段如氧化低密度脂蛋(ox-LDL)、磷酯酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、載脂蛋白B-100(ApoB-100)、熱休克蛋白65(Hsp65)、IL-12的預防接種能誘導機體的特異性免疫耐受及保護性抗體的產(chǎn)生，通過免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗AS的保護作用。既

2、往研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)糖基化蛋白和脂質(zhì)水平的升高，是促進糖尿病患者并發(fā)AS的重要因素。那么預防接種糖基化低密度脂蛋白(advancedglycationendproductoflowdensitylipoprotein，AGE-LDL)對糖尿病機體是否也能產(chǎn)生抗AS作用，目前尚不清楚。如果接種確實有效，該保護性效應的具體機制又是什么?
　　 研究目的：建立糖尿病apo-E-/-小鼠模型，證實AGE-LDL預防接種后，糖尿病機體能產(chǎn)生抗A

3、S的保護作用，并探討這種保護作用的免疫調(diào)節(jié)機制，旨在為糖尿病患者未來能通過疫苗接種的方式防治AS，提供佐證。
　　 研究方法：采用密度梯度離心方法從健康人外周血中分離LDL，用自動生化儀器測定濃度分離出的LDL與糖基化反應液孵育2周，采用熒光分光光度儀測定LDL的糖基化程度。選用雄性4周齡apo-E-/-小鼠為研究對象，正常飲食2周后更換高脂飼料喂養(yǎng)。apo-E-/-小鼠隨機分為PBS對照組(250ulPBS)、Al(OH)3凝

4、膠佐劑組(125ul凝膠+125ulPBS)、Al(OH)3凝膠+AGE-LDL聯(lián)合免疫組(125ul凝膠+125ulAGE-LDL)。apo-E-/-小鼠預防接種方案采用皮下注射，初次免疫后加強免疫3次，每2周加強1次。第16周，所有apo-E-/-小鼠進行STZ40mg/kg腹腔注射，連續(xù)注射5天。2周后觀察小鼠出現(xiàn)多飲、多尿、多食癥狀。通過多次隨機血糖測定，血糖＞11.1mmol/L為糖尿病apo-E-/-小鼠，入選后續(xù)實驗研究。

5、每周監(jiān)測體重及隨機血糖的變化，第25周為實驗終點。首先觀察各組糖尿病apo-E-/-小鼠AS斑塊面積及其穩(wěn)定性。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死，心臟穿刺抽取血液。自動生化儀測定甘油三酯、總膽固醇、HDL、LDL的水平。快速蛋白液相色譜儀測定血清脂蛋白分布。留取小鼠的主動脈，油紅染色分析AS斑塊面積。留取小鼠的主動脈根部，OCT膠包埋液氮速凍，冰凍切片油紅染色分析AS斑塊面積；分別采用Masson染色、MOMA-2染色a-SMA染色分析AS斑

6、塊中膠原、巨噬細胞、平滑肌的比例。最后探討各實驗組糖尿病apo-E-/-小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能的變化。密度梯度離心的方法分離小鼠脾細胞，一部分經(jīng)流式細胞儀分析Treg的比例，一部分經(jīng)PMA50ng/ml、inomomycin500ng/ml、monensin刺激4小時，用流式細胞儀分析Th1Th2Th17細胞的比例。ELISA方法分別檢測小鼠血清中總IgM、總IgG、anti-AGE-LDLIgM和anti-AGE-LDLIgG的水平。E

7、LISA方法分別檢測血清，及脾細胞ConA刺激后的培養(yǎng)上清中IFN-r、IL-4、IL-10、IL-17的含量。
　　 研究結(jié)果：(1)糖尿病apo-E-/-小鼠模型的建立及預防接種后的糖尿病apo-E-/-小鼠AS斑塊的變化：apo-E-/-小鼠經(jīng)STZ小劑量多次腹腔注射能成功建立糖尿病apo-E-/-小鼠模型。采用AGE-LDL與Al(OH)3凝膠混合皮下注射后發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫組小鼠與Al(OH)3凝膠佐劑組和Control組相

8、比主動脈AS斑塊的面積顯著減少，較Control組降低42％，較Al(OH)3凝膠佐劑組降低30％(P＜0.05)而Control組和Al(OH)3組小鼠的AS斑塊面積無顯著差異。主動脈根部冰凍切片分析AS斑塊面積發(fā)現(xiàn)AGE-LDL+Al(OH)3聯(lián)合免疫組AS面積較Control組及Al(OH)3組明顯降低，較Control組降低35％，較Al(OH)3組降低30％(P＜0.05)。Control組和Al(OH)3組AS斑塊面積無顯著

9、差異。但各實驗組小鼠血脂水平，脂蛋白分布及AS斑塊中MOMA-2、膠原及a-SMA的比例無明顯變化。(2)AGE-LDL與Al(OH)3凝膠佐劑聯(lián)合免疫后的糖尿病apo-E-/-小鼠抗AS作用的免疫學機制研究：評估體液免疫指標發(fā)現(xiàn)，各組小鼠血清中總IgGIgM的量雖無明顯改變，但免疫組anti-AGE-LDLIgG及anti-AGE-LDLIgM滴度(P＜0.05)明顯高于佐劑組和Control組，其中anti-AGE-LDLIgG為C

10、ontrol組和佐劑組的2.5倍。評估細胞免疫指標發(fā)現(xiàn)，AGE-LDL+Al(OH)聯(lián)合免疫組小鼠體內(nèi)Treg比例升高(P＜0.05)，Th17的比例雖有所降低但無顯著差異。而體內(nèi)Th1和Th2比例各實驗組小鼠均無顯著差異。AGE-LDL+Al(OH)3組小鼠脾細胞經(jīng)ConA刺激后，培養(yǎng)上清中IL-10的量增加(P＜0.05)，IFN-rIL-4IL-17的量無明顯改變。血清中未檢測出IFN-rIL-4的量而IL-17和IL-10的含量

11、無明顯改變。
　　 研究結(jié)論：我們的結(jié)果提示，用超速度離心法分離健康人的LDL，糖基化反應修飾后能產(chǎn)生AGE-LDL。采用STZ小劑量多次注射apo-E-/-小鼠的方法可以成功制備糖尿病apo-E-/-小鼠模型。AGE-LDL與Al(OH)3聯(lián)合免疫后，糖尿病apo-E-/-小鼠顯示抗AS作用，主要表現(xiàn)為：AS斑塊面積減少。而體內(nèi)Treg比例及IL-10的含量上調(diào)；血清中anti-AGE-LDLIgG及anti-AGE-LDLI