天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類抗體在動脈粥樣硬化中的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：
　　動脈粥樣硬化是慢性炎癥性疾病。高脂血癥時，血漿低密度脂蛋白（LDL）進入動脈壁氧化成為氧化低密度脂蛋白（oxLDL），被巨噬細胞吞噬后轉化為泡沫細胞，發(fā)生動脈粥樣硬化。既往研究證實，天然屬性IgM亞類抗體通過封閉oxLDL與巨噬細胞結合的表位，抑制巨噬細胞對oxLDL的吞噬，從而降低泡沫細胞與動脈粥樣硬化斑塊的形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)血清高濃度脂多糖/LPS與動脈粥樣硬化發(fā)病密切相關，但機理尚不十分明確。
　　目前

2、還沒有關于高脂飲食飼養(yǎng)的正常小鼠是否能夠誘導產生天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM亞類抗體，從而能影響動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展；體內或者體外應用這些天然抗體是否有保護作用；以及在LPS血清濃度升高提高動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中，這些天然抗體是否參與尚未見報道?；谝陨?，我們設計并完成了相關實驗。
　　目的：
　　1.制備并鑒定天然屬性的抗LDL及抗oxLDLIgM亞類抗體，為研究LDL和oxLDL及其天然抗體在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中

3、的作用奠定基礎。
　　2.探討天然屬性的抗oxLDLIgM亞類抗體對巨噬細胞與oxLDL結合的影響，了解其在動脈粥樣硬化發(fā)病機制中的作用。
　　3.以apoE基因敲除小鼠為研究對象，復制動脈粥樣硬化模型，研究天然屬性抗oxLDLIgM亞類抗體對apoE基因敲除小鼠血脂、血oxLDL和主動脈粥樣硬化斑塊形成的影響。
　　4.探討脂多糖活化對巨噬細胞與oxLDL結合的影響，了解脂多糖活化對天然IgM亞類抗體在動脈粥樣硬化中

4、的保護作用的破壞機理，進一步了解天然抗體在動脈粥樣硬化中的作用。
　　方法：
　　1.給予飼養(yǎng)在無特殊病原體條件下Babl/c小鼠高膽固醇飲食，4周后取脾細胞直接與SP2/0細胞融合，以純化的LDL及oxLDL為抗原對陽性雜交瘤細胞生長孔進行間接ELISA篩選。鑒定雜交瘤上清的免疫球蛋白亞類、亞型，進而采用免疫印跡、免疫沉淀法和ELISA法對獲得的抗體進行免疫學反應性鑒定。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠巨噬細胞系；純化IgM抗

5、體3A6并將其與Na125I標記的oxLDL作用形成免疫復合物。通過油紅O染色及細胞結合同位素標記oxLDL，以觀察3A6對巨噬細胞對oxLDL吞噬的封閉作用。
　　3.18只8周齡apoE基因敲除小鼠隨機分為對照組（腹腔注射PBS/2ml/周）；5G8組：（腹腔注射天然屬性抗低密度脂蛋白IgM亞類抗體5G8/10μg/g體重，2ml/周）和3A6組（腹腔注射天然屬性抗氧化低密度脂蛋白IgM抗體3A6/10μg/g體重，2ml/周

6、）。高脂飼料飼養(yǎng)16周后行處死，分離血清，測定血清脂質含量及血漿oxLDL含量，小鼠原位灌注固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，對各個切面的動脈粥樣斑塊面積進行分析。
　　4.LPS刺激巨噬細胞后，通過油紅O染色及細胞結合同位素標記oxLDL，觀察IgM抗體3A6在LPS活化巨噬細胞情況下對oxLDL吞噬地影響。分別利用TLR4的中和性單抗,p38MAPK阻抑劑SB203580和NF-κB阻抑劑PDTC作用及Fcα/μ受體進行RN

7、A干擾后，利用實時定量RT-PCR和流式細胞術觀察Fcα/μ受體mRNA轉錄及蛋白表達情況。
　　結果：
　　1.雜交瘤細胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗體通過ELISA法被篩選出來，可以與LDL或oxLDL發(fā)生高親和力結合，經過4次克隆化，最終獲得2株穩(wěn)定分泌天然屬性抗LDL抗體，命名為5G8和2H7，及1株穩(wěn)定分泌天然屬性抗oxLDL抗體，命名為3A6，3株抗體均屬于IgM亞類，無交叉反應，可以滿足免疫印跡、免疫沉

8、淀、ELISA等實驗要求。
　　2.天然屬性抗oxLDLIgM亞類抗體3A6，在體外試驗中能夠抑制巨噬細胞與銅氧化的LDL的結合，從而降低泡沫細胞的形成。
　　3.apoE基因敲除小鼠高脂飼料喂養(yǎng)16周后，三組之間的各項血脂及oxLDL含量無明顯差異；HE染色結果顯示：三組均出現(xiàn)動脈粥樣硬化斑塊，但3A6組可顯著降低胸主動脈斑塊面積和校正面積，與對照組和5G8組比較差異有顯著性。
　　4.3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬

9、細胞對銅氧化的LDL的結合，并且促進銅氧化的LDL介導的泡沫細胞的生成。我們分別利用3A6F(ab′)2、Fcα/μ受體RNA干擾或者利用不識別oxLDL的IgM抑制了oxLDL-IgM與脂多糖活化的巨噬細胞的結合，意味著Fcα/μ受體對這個過程是起作用的。同時，脂多糖促進Fcα/μ受體的表達有時間和劑量的依賴性，TLR4特異性中和抗體的封閉作用可減少LPS的作用。另外，脂多糖誘導的p38MAPK磷酸化和NF-κB65的轉位促進了Fcα

10、/μ受體表達的上調。當使用p38MAPK阻抑劑SB203580和NF-κB阻抑劑PDTC，可降低了Fcα/μ受體表達的上調。
　　結論：
　　1.抗LDL及抗oxLDLIgM亞類單抗的制備為研究天然抗體在體內脂質代謝和相關心腦血管疾病如動脈粥樣硬化等發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的研究工具。
　　2.天然屬性抗oxLDLIgM亞類抗體3A6降低了泡沫細胞的形成，可能對動脈粥樣硬化形成有預防作用。
　　3.天然屬性抗o

11、xLDLIgM亞類抗體3A6對apoE基因敲除小鼠血脂及血漿oxLDL含量無明顯影響；但對apoE基因敲除小鼠胸主動脈粥樣硬化斑塊形成有抑制作用。
　　4.3A6不能抑制脂多糖活化的巨噬細胞對oxLDL的攝取，并且通過其Fc段與巨噬細胞的結合而促進了oxLDL介導的泡沫細胞的生成。脂多糖通過TLR-4受體活化了p38MAPK和NF-κB通路，并且上調了Fcα/μ受體在巨噬細胞表面的表達。
　　5.我們的研究結果證實了LPS濃