HSP90基因多態(tài)性與嚴(yán)重創(chuàng)傷后多器官功能障礙的關(guān)系及其阻斷劑的抗炎作用機制.pdf

1、隨著社會的進步和現(xiàn)代化交通工具的發(fā)展，嚴(yán)重創(chuàng)傷及并發(fā)的多器官功能障礙無疑成為常見而重要的臨床危重疾病，尤其是多器官功能衰竭，是臨床危重患者的重要死因之一。然而創(chuàng)傷程度相同（ISS評分相當(dāng)）的患者發(fā)生這種并發(fā)癥的幾率并不相同，經(jīng)過相同的治療后有的患者病情減輕，有的患者病情不斷惡化。隨著人類基因組研究的不斷深入，人們逐漸認識到遺傳背景的差異是包括創(chuàng)傷在內(nèi)的多種疾病發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　熱休克蛋白(Heat shock pr

2、otein，HSP)是廣泛存在于從細菌到真核生物細胞內(nèi)的保守的分子伴侶蛋白，在機體遭受創(chuàng)傷、感染、手術(shù)、缺氧、重金屬、放射等應(yīng)激條件下大量增加，保護機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。HSP90作為熱休克蛋白的一種，有眾多與炎癥相關(guān)的客戶蛋白，其中包括具有抑炎效應(yīng)的HPA軸的重要效應(yīng)分子GR和具有促炎作用的TLR4信號通路的相關(guān)分子等。鑒于HSP90在炎癥反應(yīng)中的重要作用，其基因多態(tài)性與創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)及器官功能的損傷有何關(guān)系，如何提高HSP90的抑炎效應(yīng)

3、是本課題的關(guān)注重點。
　　為此，本課題擬對重慶地區(qū)部分漢族人和嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的HSP90β基因SNP進行檢測、分析和比較，了解各SNP的發(fā)生頻率及其基因型分布特點，并采用體外細胞實驗對不同基因型攜帶者的白細胞LPS刺激后HSP90β基因表達水平的變化及炎性因子的表達水平進行檢測。通過構(gòu)建含不同HSP90基因型啟動子的熒光素酶表達載體驗證SNP對HSP90β基因轉(zhuǎn)錄活性的影響。在此基礎(chǔ)上，觀察不同的基因型與嚴(yán)重創(chuàng)傷患者的多器官功能的損

4、傷嚴(yán)重程度的關(guān)系，進一步明確HSP90β基因SNPs在創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)以及多器官功能中的臨床意義。
　　此外，盡管HSP90的保護作用已經(jīng)得到認可，但是在不同的損傷模型中的作用機制尚不明確。有研究表明HSP90阻斷劑也具有減輕炎癥反應(yīng)、降低膿毒癥小鼠死亡率的保護效應(yīng)，這與公認的觀點相悖，如何調(diào)控HSP90才能使其更好發(fā)揮抑炎的保護作用，本課題擬對HSP90及其阻斷劑看似矛盾的作用進行研究，以期闡明HSP90及其阻斷劑產(chǎn)生保護作用的機

5、制和條件。本課題通過CLP所致膿毒癥模型和LPS誘導(dǎo)的細胞模型檢測不同劑量條件下HSP90阻斷劑17-AAG的作用，并分析主要抑炎信號通路GC-GR通路和促炎的TLR4信號通路，以及二者之間的關(guān)系，為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)有效的抗炎藥物提供理論支持和實驗依據(jù)。
　　主要結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1.重慶人群中HSP90β基因啟動子區(qū)存在七個高頻突變位點，分別為-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A、

6、-144C/A和-141 T/C，其突變頻率分別為0.260、0.250、0.250、0.220、0.313、0.285和0.434。其中-741G/C、-509C/T、-427A/C、-398 C/G、-257G/A五個位點呈緊密連鎖，-144C/A、-141 T/C位點之間以及與以上五個位點之呈連鎖不平衡關(guān)系。
　　2.體外轉(zhuǎn)錄活性檢測的實驗數(shù)據(jù)表明突變型-144A啟動子較野生型-144C啟動子具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，可以促進靶基

7、因的轉(zhuǎn)錄。定量PCR的結(jié)果證實-144突變型基因攜帶者的外周血白細胞具有較高的HSP90β的基礎(chǔ)表達，并且在LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中具有較低的炎性因子TNF-α的表達，表明此位點為功能性多態(tài)位點，通過改變啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進而調(diào)節(jié)HSP90β基因的表達。
　　3.進一步的臨床關(guān)聯(lián)研究表明HSP90β基因-144AA基因型患者的多器官功能評分顯著低于-144CC基因型，表明此位點SNP與嚴(yán)重創(chuàng)傷后各器官功能損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)，我們推測-

8、144位點突變導(dǎo)致的HSP90β表達水平的差異是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)差異性的重要原因之一，在嚴(yán)重創(chuàng)傷患者并發(fā)癥的發(fā)生和進展中具有重要意義。
　　4.在CLP小鼠膿毒癥模型和LPS刺激的細胞模型中較低濃度的17-AAG(0.1μM)可以促發(fā)以HSP90表達增高為特征的熱休克反應(yīng)，降低TFN-α、IL-1β等炎癥因子的表達水平，但較高濃度的17-AAG(0.5μM)盡管使HSP90蛋白水平增高，卻具有相反的作用，增加炎癥因子的表達，加重損傷。

9、
　　5.在小鼠膿毒癥模型中17-AAG可以顯著的提高3h和24h時相點P-HSF1的水平因而提高HSP90的蛋白表達。低劑量17-AAG(0.5mg/kg)可以顯著降低24h時相點TLR4的表達，而高劑量17-AAG(2.5mg/kg)對TLR4的表達無顯著影響。
　　6.細胞實驗的數(shù)據(jù)表明低和高劑量的17-AAG都可以顯著的提高P-HSF1的水平，進而促進HSP90的轉(zhuǎn)錄和表達，并且呈劑量依賴性增高。但是僅當(dāng)?shù)蜐舛鹊?7

10、-AAG(0.1μM)存在時對機體產(chǎn)生保護作用，并且主要是通過促進GC-GR信號通路進而促進其調(diào)節(jié)的下游靶基因Lipocortin-1的表達而實現(xiàn)的。與此相反，高濃度的17-AAG(0.5μM)盡管增加了HSP90的表達水平，卻可以抑制HSP90的活性進而阻斷GC-GR信號通路，抑制Lipocortin-1的生成，進而促進炎性因子TFN-α的產(chǎn)生，加重損傷。
　　7.細胞實驗表明分別單獨給予低濃度的17-AAG(0.1μM)和DE

11、X(50nM)都可降低TLR4的蛋白水平，并且二者同時使用具有協(xié)同作用，使TLR4的表達在24h表達更低。已有實驗數(shù)據(jù)證明HSP90的增加可以促進GR的核轉(zhuǎn)位而增強GR效應(yīng)，因此我們推測表明17-AAG通過增加HSP90的表達促進DEX介導(dǎo)的GR效應(yīng)，間接發(fā)揮抗炎保護效應(yīng)。
　　總之，HSP90是一種具有保護作用的分子已被廣泛認可，較低劑量的HSP90阻斷劑由于其具有促進熱休克反應(yīng)和對客戶蛋白的調(diào)節(jié)的差異性，使得較低濃度的阻斷劑1