三種中藥制劑促化療增敏作用的體外實驗.pdf

1、背景和目的
　　 癌癥嚴重威脅人們的生命健康,其發(fā)病率近年來逐漸增加,近10年來增加更為明顯。早期的腫瘤患者主要采取外科手術的治療方法,但是許多患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時已經發(fā)展到中晚期,不再適合手術切除,化療成為主要的治療手段。在腫瘤臨床實踐中我們經常發(fā)現(xiàn):一些生長不快、病理分化好的惡性腫瘤對化療藥敏感性差；然而一些生長很快、病理分化級別低的惡性腫瘤對化療藥敏感性卻很好。導致此種情況發(fā)生的一個重要因素就是病理類型不同的腫瘤細胞處于不同的細

2、胞分裂周期,因而,單獨使用周期特異性的化療藥不會達到全部殺死所有癌細胞的目的。目前惡性腫瘤的綜合治療已經被腫瘤臨床醫(yī)師廣為接受,中醫(yī)藥的治療手段也是腫瘤綜合治療方案中的重要一環(huán)。現(xiàn)代藥理學研究證明中藥可以通過促進腫瘤細胞凋亡、調節(jié)機體免疫功能和直接殺死腫瘤細胞等途徑來達到抗腫瘤的療效。杜仲、菟絲子和肉蓯蓉都是常用的補益類中藥。據(jù)報道,杜仲提取物可促進大鼠膠原蛋白合成和表皮細胞的增殖；菟絲子總黃酮對成骨細胞活性有促進作用,并且可促進小鼠免

3、疫器官胸腺、脾臟增長,提高巨噬細胞的吞噬功能,促進淋巴細胞增殖反應；肉蓯蓉多糖也能夠明顯提高巨噬細胞的吞噬和分泌功能,活化巨噬細胞,并可明顯促進小鼠脾淋巴細胞增殖。據(jù)此,我們是否可以推測這三位補益中藥對腫瘤細胞也有一定促增殖作用呢?其是否具有一定促進腫瘤細胞代謝的作呢?補益中藥是否具有改變腫瘤細胞周期時相的作用,使腫瘤細胞經中藥作用后集中到某一細胞周期時相,如S期、G1期或者M期,然后再使用某一周期特異性化療藥物殺滅之,從而提高了腫瘤細

4、胞對化療藥的敏感性?
　　 方法：
　　 1細胞培養(yǎng)將食管癌細胞Ec9706接種于含體積分數(shù)10％滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。在37℃、體積分數(shù)5％CO2、相對濕度為95％的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1～2d換液一次,1～2d或2～3d傳代。
　　 2 MTT法初步篩選出最能促使食管癌細胞Ec9706生長的三位中藥
　　 3測定細胞生長增殖率取對數(shù)生長期的Ec9706細胞,制成單細胞懸液,接種于

5、96孔板中。每孔大約1000～3000個腫瘤細胞,體積100μl,培養(yǎng)24小時后,按預先設計將不同濃度中藥試劑加入孔中,體積為100μl,每組設置若干重復孔,分別設置空白對照孔、調零孔和本底對照孔。在37℃、體積分數(shù)為5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后,利用噻唑藍(MTT)還原法檢測藥物組細胞的生長增殖率。重復實驗3次。
　　 4繪制出三位中藥的生長曲線取對數(shù)生長期Ec9706細胞,制成單細胞懸液,接種于96孔板中。每孔約10

6、00～3000個細胞,體積為100μl,培養(yǎng)24h后,分別將40mg/ml杜仲試劑、20mg/ml菟絲子試劑,30mg/ml肉蓯蓉試劑加入板中,每孔100μl,每天取出一板,以MTT法進行比色檢測,記錄OD值,共記錄6天,繪制生長曲線。
　　 5流式細胞儀檢測細胞周期
　　 6用免疫細胞化學分析細胞周期蛋白D的表達情況S-P染色法分析實驗組與對照組Ec9706細胞中cyclinD蛋白的表達情況。
　　 7通過MT

7、T法測定中藥聯(lián)合5-fu對Ec9706細胞的抑制作用取對數(shù)生長期的Ec9706細胞,制成單細胞懸液,接種于96孔板中。每孔約1000～3000個細胞,體積為100μl,培養(yǎng)12h后,按實驗設計將最佳濃度的中藥制劑和5-fu加入孔中,體積為100μl,分別設單獨5-fu組,5-fu加中藥組和空白對照組,每組設置若干重復孔。在37℃、體積分數(shù)5％CO2細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,采用噻唑藍(MTT)還原法檢測各組細胞的生長

8、抑制率。重復實驗3次。
　　 8統(tǒng)計學分析采用統(tǒng)計軟件SPSS13.0,采用單因素方差分析及x2檢驗對數(shù)據(jù)進行分析,以α=0.05為檢驗水準。
　　 結果：
　　 1經MTT法測定出諸位補益類中藥促增殖作用最明顯的三位中藥是杜仲、菟絲子、肉蓯蓉。
　　 杜仲、菟絲子、肉蓯蓉在一定濃度范圍內對食管癌細胞株Ec9706有一定促增殖作用。杜仲促增殖的濃度范圍在1-40mg/ml,且40mg/ml時的增殖作用最明

9、顯。菟絲子的促增殖濃度范圍在1-20mg/ml,且20mg/ml時增殖作用最明顯。肉蓯蓉促增殖濃度范圍在1-30mg/ml,且30mg/ml時增殖作用最明顯。以上各濃度組的增殖率與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)
　　 2流式細胞儀檢測細胞周期分布
　　 藥物作用于細胞72h后,實驗組細胞周期各時相的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比與對照組比較有明顯的不同。S期細胞百分率明顯升高,G1期細胞百分率明顯下降。實驗組細

10、胞S期百分率與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3細胞免疫化學對Ec9706細胞周期蛋白D表達的檢測
　　 經藥物作用后的實驗組和空白對照組均有cyclinD蛋白表達,陽性部位位于胞核和胞漿。經杜仲作用后的Ec9706細胞cyclinD蛋白陽性表達率0.642±0.033,經菟絲子作用后的Ec9706細胞cyclinD蛋白陽性表達率為0.632±0.022,經肉蓯蓉作用后的Ec9706細胞cycli

11、nD蛋白陽性表達率為0.562±0.023,對照組細胞cyclinD蛋白陽性表達率為0.426±0.029。
　　 4三種中藥制劑的最佳濃度聯(lián)合5-fu化療提高了5-fu對Ec9706的抑制作用,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結論：
　　 1杜仲、菟絲子、肉蓯蓉對食管癌Ec9706細胞均具有一定的促增殖作用。
　　 2經杜仲、菟絲子、肉蓯蓉作用后的食管癌Ec9706細胞各周期時相,