hSp17-EGFP共表達(dá)卵巢癌細(xì)胞模型的建立.pdf

1、精子蛋白17(sperm protein 17，Sp17)是一種睪丸特異性蛋白，最初是作為一種精子自身抗原成分從兔睪丸的精子膜和睪丸膜沉淀物中分離得到，是一種高度保守的哺乳動物蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)Sp17在睪丸中表達(dá)豐富，在前列腺中僅有微弱表達(dá)，而其他組織包括腦、結(jié)腸、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰腺、骨骼肌、脾、骨髓則未能檢出Sp17基因表達(dá)。同時發(fā)現(xiàn)Sp17在多種惡性腫瘤如多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、食管癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、鼻腔神經(jīng)膠質(zhì)瘤等中有高水平

2、的表達(dá)，被認(rèn)為屬于腫瘤/睪丸(cancer/testics，CT)抗原的一種。明確該基因的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并以此為標(biāo)志，來判斷腫瘤性疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸、制定恰當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┝酥匾膮⒖夹畔ⅰ?目前對Sp17的生物學(xué)功能了解的很少，其作用可能是與透明帶上的糖基結(jié)合而促進(jìn)受精作用，并能促進(jìn)硫酸乙酰肝素介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞粘附和聚集。研究發(fā)現(xiàn)Sp17在呼吸道以及男性和女性生殖道纖毛上皮細(xì)胞和精子尾部表達(dá)。一位日本學(xué)者將Sp

3、17 siRNA轉(zhuǎn)染卵巢透明細(xì)胞癌ES-2細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)sigNA在抑制Sp17 mRNA表達(dá)的同時，也增強(qiáng)了ES-2細(xì)胞對抗癌藥物紫杉醇的敏感性。這些結(jié)果提示Sp17蛋白的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的遷移、耐藥性有關(guān)。 為了進(jìn)一步了解Sp17的異常表達(dá)對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響，本課題開展了如下研究： 1.hSp17/EGFP共表達(dá)載體的構(gòu)建 用含報告基因-增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhance green fluore

4、scent protein，EGFP)基因的質(zhì)粒pEGFP-N1作為真核表達(dá)載體，以帶有hSp17基因的質(zhì)粒pGEM-T/hSp17為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取hSp17基因片段。將純化后的目的片段和pEGFP-N1質(zhì)粒分別經(jīng)HindⅢ/Kpn Ⅰ雙酶切，然后T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建hSp17的重組表達(dá)載體pEGFP-N1/hSp17，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進(jìn)行質(zhì)粒的擴(kuò)增。采用兩種方法鑒定重組質(zhì)粒：一種是菌落PCR，即挑取單

5、菌落作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；一種是提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切。兩種方法均得到與原克隆片段大小相等的條帶后，經(jīng)DNA序列測定進(jìn)一步證實(shí)。 2.穩(wěn)定共表達(dá)hSp17/EGFP的卵巢癌細(xì)胞模型的建立 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到卵巢癌HO8910細(xì)胞中，熒光倒置顯微鏡下觀察hSp17/EGFP融合蛋白的表達(dá)，RT-PCR檢測hSp17 mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)與Western blot檢測hSp17蛋白的表達(dá)。最

6、后用G418進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)hSp17/EGFP的細(xì)胞株HO8910/hSp17，同時篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞株HO8910/EGFP作為陰性對照。體外長期傳代培養(yǎng)和液氮凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，熒光表達(dá)較強(qiáng)，目的分子表達(dá)穩(wěn)定。 3.細(xì)胞遷移性的變化 采用Transwell小室裝置，利用小室底部聚碳酸酯膜上下營養(yǎng)成分的差異促使細(xì)胞遷移，將穿過膜的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)，比較HO8910/hSp17細(xì)胞

7、與HO8910/EGFP細(xì)胞遷移率的差別。 4.細(xì)胞藥物耐受性變化 分別將2×104個HO8910/hSp17與HO8910/EGFP細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入培養(yǎng)液稀釋的抗癌藥物順鉑和卡鉑，繼續(xù)培養(yǎng)48h，MTT法檢測細(xì)胞的存活率，依此計算HO8910/hSp17細(xì)胞對順鉑和卡鉑的耐藥指數(shù)。 5.結(jié)論： 1.成功建立hSp17與EGFP蛋白穩(wěn)定共表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞模型； 2.Sp17蛋