雪旺細(xì)胞分離培養(yǎng)及其與修復(fù)神經(jīng)的自組裝材料作用研究.pdf

1、雪旺細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是形成周圍神經(jīng)髓鞘的膠質(zhì)細(xì)胞，1839年德國科學(xué)家Theodor Schwann最先描述。移植的雪旺細(xì)胞可在周圍神經(jīng)內(nèi)存活、增殖、遷移和分化，它可分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)、細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)，促進和引導(dǎo)周圍神經(jīng)軸突的再生。雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)再生修復(fù)過程中起著非常重要的作用，雪旺細(xì)胞和功能的恢復(fù)被公認(rèn)為是周圍神經(jīng)再生的兩個最重要因素。 該論文研究是為了尋找一種分離方法，能

2、在短時間內(nèi)從新生(1～2天)的Wister大鼠乳鼠的坐骨神經(jīng)分離和培養(yǎng)出原代雪旺細(xì)胞，而且還要求其在數(shù)量上達(dá)到10<'6>/ml以上，純度達(dá)到90％以上，來滿足用人工材料修復(fù)缺損的周圍神經(jīng)的臨床需要。將增值一定數(shù)量的雪旺細(xì)胞種植于修復(fù)周圍神經(jīng)的自組裝材料(聚乳酸一殼聚糖一硫酸軟骨素，PDLLA-CHS-CS)，檢測自組裝制備的PDLLA-CHS-CS材料的生物相容性和PDLLA-CHS-CS材料對雪旺細(xì)胞增值的影響。將PDLLA-CHS

3、-CS材料修復(fù)成年Wister大鼠的坐骨神。經(jīng)，研究PDLL-CHS-CS材料對修復(fù)周圍神經(jīng)的影響。 雪旺細(xì)胞的分離采用了組織塊法、熱酶消化法、冷酶分步消化法和冷酶聯(lián)合消化法。神經(jīng)組織塊通過以上四種不同分離方法得到的細(xì)胞，行雙30min差速貼壁后，并對四種方法分離出來的細(xì)胞總數(shù)、活細(xì)胞的數(shù)量以及雪旺細(xì)胞的純度進行比較，得出冷酶聯(lián)合消化法從分離時間、純度、濃度和細(xì)胞活性，均能達(dá)到從自體組織快速分離和培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的要求。 雪

4、旺細(xì)胞的培養(yǎng)采用的培養(yǎng)液是DMEM/F12+10％FBS(胎牛血清)，用有絲分裂抑制劑(阿糖胞苷，Ara-C)去除或抑制成纖維細(xì)胞生長，用成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)使雪旺細(xì)胞得到進一步增殖。通過一代的培養(yǎng)，雪旺細(xì)胞的濃度達(dá)到10<'6>/ml以上，雪旺細(xì)胞的純度達(dá)到90％以上，在數(shù)量和純度上能夠滿足雪旺細(xì)胞種植于材料修復(fù)周圍神經(jīng)的需要。用MTT試驗繪制雪旺細(xì)胞的生長曲線，得出雪旺細(xì)胞的倍增時間在2～7天。雪旺細(xì)胞的鑒定采用了常規(guī)HE

5、形態(tài)染色和免疫組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)染色使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗S-100蛋白細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色和異硫氰酸熒光(FITC)標(biāo)記的抗NGFRp75蛋白細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色。聚乳酸(PDLLA)，殼聚糖(CHS)具有良好的生物相容性，硫酸軟骨素(CS)是細(xì)胞外基質(zhì)的成分之一，具有促進周圍神經(jīng)再生的作用。通過靜電自組裝將PDLLA,CHS,CS制備成多層的復(fù)合材料，即克服了聚乳酸降解慢等缺點，也克服了殼聚糖機械強度不夠等弱點，再添加一

6、些能促進雪旺細(xì)胞增殖的細(xì)胞外基質(zhì)成分，應(yīng)是一種理想的周圍神經(jīng)缺損修復(fù)材料。通過在PDLLA，CHS,PDLLA-CHS-CS復(fù)合材料上種植雪旺細(xì)胞進行培養(yǎng)的一段時間進行體外實驗，如：MTT實驗，激光掃描共聚焦顯微鏡和環(huán)掃電鏡觀察材料表面細(xì)胞生長的情況。結(jié)果顯示PDLLA-CHS-CS復(fù)合材料與雪旺細(xì)胞具有良好的親和性和良好的生物相容性，而且PDLLA-CHS-CS復(fù)合材料相對于基體材料PDLLA，CHS對雪旺細(xì)胞的增殖作用更加明顯。