rhTrx-1對(duì)腦缺血后神經(jīng)再生及認(rèn)知功能障礙的影響.pdf

1、背景：
　　目前,腦中風(fēng)治療的藥物和方法有限且效果欠佳。腦缺血可誘發(fā)海馬神經(jīng)元丟失從而導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損。雖然腦缺血后大腦中側(cè)腦室室下區(qū)和海馬齒狀回中神經(jīng)干/祖細(xì)胞持續(xù)不斷的增殖,但是神經(jīng)再生的作用仍存在爭(zhēng)議。腦缺血后新生的神經(jīng)元可以向缺血部位發(fā)生遷移、分化、成熟后可整合入大腦回路中發(fā)揮作用,因此神經(jīng)再生被認(rèn)為是成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在的一種內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制,促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生治療缺血性中風(fēng)為腦保護(hù)策略提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。

2、r>　　硫氧還蛋白(Thioredoxin,Trx)是一分子量為12kD的控制還原/氧化狀態(tài)和細(xì)胞增殖/生存的小分子蛋白質(zhì),通過(guò)其二硫醇-二硫化物的活性位點(diǎn),參與機(jī)體細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)以及發(fā)揮抗凋亡作用等過(guò)程。因此,Trx系統(tǒng)被認(rèn)為是除谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)系統(tǒng)之外的另一內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在三種形式的Trx,胞質(zhì)型 Trx-1、線(xiàn)粒體型 Trx-2以及精細(xì)胞中存在的一種Trx變體 SpTrx

3、/Trx3,其中 Trx-1是機(jī)體內(nèi)的主要形式,當(dāng)腦缺血發(fā)生時(shí)可以誘導(dǎo)內(nèi)源性 Trx-1生成,減輕氧化損傷。作為一種抗氧化劑,在腦缺血模型中外源性給予人重組硫氧還蛋白(rhTrx-1)可以穿透血腦屏障發(fā)揮抗凋亡作用。除了其氧化還原酶的活性之外,近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn) rhTrx-1也可促進(jìn)人體脂肪組織源性的間充質(zhì)干細(xì)胞和血管生成。
　　因此我們推測(cè),rhTrx-1可以通過(guò)促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞再生,改善全腦缺血后空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降

4、,產(chǎn)生腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠全腦缺血模型和海馬神經(jīng)元離體培養(yǎng),運(yùn)用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)及 Western Blot等技術(shù),對(duì) rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用進(jìn)行研究,探討其機(jī)制可能與 rhTrx-1可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和向神經(jīng)元方向分化作用有關(guān),揭示 MEK/ERK信號(hào)通路可能參與了 rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用,初步構(gòu)建了 rhTrx-1促神經(jīng)再生作用與 MEK/ERK信號(hào)通路間的相互關(guān)系,為將 rhTrx-1應(yīng)用于臨床治療腦

5、中風(fēng)提供新的理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一 rhTrx-1對(duì)小鼠全腦缺血后認(rèn)知功能的影響
　　目的：探討 rhTrx-1對(duì)腦缺血小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響,為其機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉方法,制作小鼠全腦缺血 BCCAO模型。1.8-12周齡SPF級(jí)雄性 C57BL/6J小鼠(18-22g),由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,隨機(jī)分為3組(n=5):假手術(shù)組(sham組)、缺血+溶劑組(CI+vehicle

6、組)、缺血+人重組硫氧還蛋白治療組(CI+rhTrx-1組),rhTrx-1及vehicle均在 BCCAO再灌前10min通過(guò)腹腔注射方式給予,于再灌注72h后行 Nissl染色,在高倍鏡下觀察海馬 CA1區(qū)神經(jīng)元受損情況并對(duì)各組間存活的健康神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.8-12周齡SPF級(jí)雄性 C57BL/6J小鼠(18-22g),隨機(jī)分為3組(n=8):sham組、CI+vehicle組、CI+rhTrx-1組,于再灌注后30d進(jìn)行行為

7、學(xué)觀察,觀察指標(biāo)為曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和Morris水迷宮測(cè)試。3.為排除麻醉藥物吸入過(guò)程可能會(huì)造成的低氧血癥或是高碳酸血癥的發(fā)生,單獨(dú)使用3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(n=5):sham組、CI+vehicle組及CI+rhTrx-1組行左頸總動(dòng)脈置管。每只小鼠分別在 BCCAO即刻和再灌注即刻自頸總動(dòng)脈取血約0.2ml進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)鉁y(cè)定。
　　結(jié)果：1.血?dú)夥治?結(jié)果顯示不同組間雙側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉即刻和再灌注即刻動(dòng)物動(dòng)脈血?dú)夥治鰺o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,排除低氧血癥影響

8、。2.Nissl染色結(jié)果:CI+vehicle組與 CI+rhTrx-1組健康神經(jīng)元數(shù)目較 sham組相比均明顯降低(P<0.01);而CI+rhTrx-1健康神經(jīng)元較 CI+vehicle組數(shù)量增加(P<0.01)。3.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):結(jié)果顯示活動(dòng)總路程及中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間兩檢測(cè)指標(biāo)各組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說(shuō)明腦缺血并沒(méi)有影響小鼠自主運(yùn)動(dòng)能力。4. Morris水迷宮:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與CI+vehicle組相比,CI+rhTrx-

9、1組小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力明顯提高,游泳總路程和游泳速度各組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異說(shuō)明小鼠認(rèn)知能力的改善并不是因?yàn)榧×ο陆邓鸬摹?br>　　結(jié)論： rhTrx-1可以改善腦缺血后小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。
　　實(shí)驗(yàn)二 rhTrx-1對(duì)腦缺血后海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響
　　目的：探討rhTrx-1對(duì)腦缺血后海馬齒狀回神經(jīng)再生作用的影響,建立認(rèn)知功能與神經(jīng)再生之間的聯(lián)系。
　　方法：8-12周齡 SPF級(jí)雄性 C57BL/6J

10、小鼠(18-22g),隨機(jī)分為3組(n=12):sham, CI+vehicle組和 CI+rhTrx-1組,分別于BCCAO再灌注后14d進(jìn)行 BrdU/Hoechst、Ki67/Hoechst和 DCX免疫熒光染色檢測(cè) rhTrx-1對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響;于 BCCAO再灌注后30d進(jìn)行 BrdU/NeuN免疫熒光染色,檢測(cè) rhTrx-1對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖作用的影響。
　　結(jié)果：海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)

11、胞增殖情況:1. BrdU和 Ki67染色結(jié)果。CI+vehicle組 BrdU+細(xì)胞較 Sham組相比增加至約1.5倍(P<0.05);較 CI+vehicle組相比 CI+rhTrx-1組 BrdU+細(xì)胞數(shù)增加顯著(P<0.01)。同樣,較 Sham組相比CI+vehicle組 Ki67+細(xì)胞增加明顯(P<0.05),并且在 CI+rhTrx-1組 Ki67+細(xì)胞數(shù)增加至約2倍(P<0.01)。2. DCX染色結(jié)果。較 CI+veh

12、icle組相比海馬齒狀回中 CI+rhTrx-1組 DCX+細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)。海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞分化情況:BrdU+/NeuN+染色結(jié)果。CI+rhTrx-1組 BrdU+細(xì)胞較 CI+vehicle組明顯增加(P<0.01),表示 rhTrx-1可促進(jìn)新生神經(jīng)元數(shù)目的增加及存活;但是,免疫熒光雙標(biāo)染色顯示,與 CI+vehicle組相比 BrdU+/NeuN+與 BrdU+的比例卻沒(méi)有變化(P>0.05),說(shuō)明rhTr

13、x-1對(duì)缺血后海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞分化沒(méi)有影響。
　　結(jié)論：rhTrx-1可以促進(jìn)小鼠全腦缺血后海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖,但對(duì)其分化沒(méi)有影響。
　　實(shí)驗(yàn)三 rhTrx-1對(duì)離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞再生的影響及機(jī)制研究
　　目的：探討 rhTrx-1對(duì)離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞再生的影響,明確其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：清潔級(jí)孕14-16d的Sprague-Dawley(SD)大鼠,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,進(jìn)行原代海馬神經(jīng)干

14、細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定和傳代。1.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分為5組:Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1組,48h后觀察在不同濃度 rhTrx-1作用下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況。2.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分為5組:Vehicle,1,10,50,100μg/ml rhTrx-1組,7d后觀察在不同濃度 rhTrx-1作用下神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況。3.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分為4組:0h,2h,24h,48h組,48h后觀察在10μg/m

15、l rhTrx-1作用下不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)再生相關(guān)信號(hào)通路 MEK/ERK和 PI3K/Akt表達(dá)變化情況。4.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞共為4組:Vehicle, rhTrx-1, U0126, rhTrx-1+U0126組,觀察 MEK/ERK信號(hào)通路抑制劑---U0126對(duì) rhTrx-1促神經(jīng)干細(xì)胞增殖(培養(yǎng)48h)和分化(培養(yǎng)7d)作用的影響。
　　結(jié)果：1.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞鑒定:免疫熒光染色結(jié)果顯示無(wú)論是克隆球還是單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞

16、均表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物---巢蛋白。2.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖情況:1).細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果顯示:10,50,100μg/ml rhTrx-1組細(xì)胞活力較 Vehicle組相比明顯增加(P<0.01),三組濃度間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2). BrdU和 Ki67免疫熒光染色結(jié)果:10,50,100μg/ml rhTrx-1組 BrdU+細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01);1,10,50μg/ml rhTrx-1組 Ki67+細(xì)胞數(shù)目明顯增加(

17、1μg/ml P<0.05;10,50μg/ml P<0.01)。3.離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞分化情況:1). Tuj1和 GFAP免疫熒光染色結(jié)果:與 Vehicle組(7.21％)相比,1,10μg/ml rhTrx-1組 Tuj1+細(xì)胞數(shù)目明顯增加(1μg/ml P<0.05,13.51%;10μg/ml P<0.01,18.08%);同樣,1,10μg/ml rhTrx-1組GFAP+細(xì)胞數(shù)目明顯降低(P<0.05)。2). West

18、ern Blot分析結(jié)果同樣表明:10μg/ml rhTrx-1組 Tuj1表達(dá)量增加約1.5倍(P<0.05),GFAP的表達(dá)量在10μg/ml rhTrx-1組也明顯下降(P<0.05)。4. MEK/ERK而不是PI3K/Akt信號(hào)通路參與rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用: Western Blot結(jié)果顯示rhTrx-1加入2h后 pERK表達(dá)開(kāi)始增加(P<0.05),直至48h仍能維持較高水平(P<0.01);而 pAkt表達(dá)無(wú)明

19、顯變化(P>0.05)。5. MEK/ERK信號(hào)通路抑制劑---U0126抑制了 rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用:1). Western Blot結(jié)果顯示U0126可以抑制rhTrx-1促進(jìn)的pERK表達(dá)增加(P<0.05)。2).免疫熒光染色的結(jié)果顯示 U0126可以抑制rhTrx-1促進(jìn)的BrdU+(P<0.05)和Tuj1+(P<0.01)細(xì)胞數(shù)目增加。
　　結(jié)論：rhTrx-1可以促進(jìn)離體培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化作用,并且

20、MEK/ERK而不是PI3K/Akt信號(hào)通路參與了 rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用。
　　總結(jié)
　　我們研究發(fā)現(xiàn),外源性給予 rhTrx-1可以促進(jìn)小鼠全腦缺血后海馬齒狀回神經(jīng)再生,改善腦缺血后小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。其機(jī)制可能與rhTrx-1可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化作用有關(guān),并且 MEK/ERK信號(hào)通路參與了 rhTrx-1的促神經(jīng)再生作用,初步構(gòu)建了 rhTrx-1促神經(jīng)再生作用與 MEK/ERK信