常見人體腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立及相關(guān)機(jī)理研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移性是惡性腫瘤主要的生物學(xué)特性之一，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因，即使對(duì)患者實(shí)施腫瘤切除，術(shù)后轉(zhuǎn)移的發(fā)生也是影響手術(shù)療效的主要障礙。腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過程。因此，研究腫瘤的轉(zhuǎn)移，就必然要建立與臨床表現(xiàn)相近的腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。人體腫瘤移植于裸小鼠建立人癌異種移植動(dòng)物模型為腫瘤的深入研究提供了可能。皮下移植和原位移植是目前常用的兩種方法。原位移植由于獲得與人體腫瘤生長相似的微環(huán)境，更利于腫瘤惡性行為的表達(dá)

2、，因此，建立腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型大多采用原位移植的方法。肝癌、胃癌和肺癌是常見的腫瘤，利用這三種腫瘤進(jìn)行研究具有一定的代表意義。本課題利用不同程度免疫缺陷小鼠觀察了人肝癌原位移植腫瘤在宿主體內(nèi)的生物學(xué)特性差異；模擬臨床，建立了人肝癌和人肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型；同時(shí)利用經(jīng)體內(nèi)篩選建立的人胃癌高轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型以及建立的人胃癌細(xì)胞株MKN-45mc，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。 一、目的 1．建立人肝癌NOD-SCID小鼠和裸小鼠原

3、位移植模型，并通過兩種模型生物學(xué)特性的比較，對(duì)不同類型免疫缺陷動(dòng)物在人肝癌異種移植方面的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行初步探討。 2．建立人肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，觀察并比較手術(shù)切除腫瘤后對(duì)人肝癌小鼠皮下移植模型和原位移植模型的影響。 3．建立裸小鼠人肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模型，為研究肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制和術(shù)后抗轉(zhuǎn)移治療提供適宜的動(dòng)物模型。 4．比較體內(nèi)篩選前后建立的人胃癌原位移植動(dòng)物模型，以及人胃癌細(xì)胞株MKN-45mc和MKN-45生物學(xué)特性出

4、現(xiàn)的差異，對(duì)轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。 二、方法 1．將組織結(jié)構(gòu)完整的SMMC-LTNM瘤塊植入NOD-SCID小鼠和裸小鼠肝臟內(nèi)，建立人肝癌原位移植模型。觀察成瘤率、腫瘤體積和重量、臟器的轉(zhuǎn)移情況以及血清甲胎蛋白(AFP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ(γ-GTⅡ)等指標(biāo)。 2．將組織結(jié)構(gòu)完整的HC-031瘤塊植入NOD-SCID小鼠皮下和肝臟內(nèi)，分別建立人肝癌皮下移植和原位移植模型。模擬臨床腫瘤手術(shù)切除方法，切除皮

5、下移植瘤和原位移植瘤，建立肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模型。觀察腫瘤生長和動(dòng)物的生存狀況。通過病理解剖和組織病理學(xué)技術(shù)研究腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。 3．將人非小細(xì)胞肺癌NCI-H460組織塊植入裸小鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。4w后，25只裸小鼠作為手術(shù)組切除腫瘤組織，建立術(shù)后轉(zhuǎn)移模型，15只裸小鼠作為對(duì)照組。每兩周兩組各處死5只動(dòng)物動(dòng)態(tài)觀察其遠(yuǎn)處各臟器轉(zhuǎn)移情況。動(dòng)物明顯消瘦時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)。采用免疫組化方法檢測(cè)MMP-2、OPN、CD44v6、CD

6、62等蛋白在轉(zhuǎn)移灶及原發(fā)灶的表達(dá)情況。 4．用人胃癌MKN-45sci和MKN-45腫瘤組織塊建立人胃癌原位移植動(dòng)物模型，觀察并比較兩種模型的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、血清腫瘤標(biāo)志物及MMP-2、OPN、CD44v6、CD62與Timp-2的表達(dá)情況。取MKN-45sci肝轉(zhuǎn)移灶形成的皮下移植瘤，用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，建立MKN-45mc細(xì)胞株，觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長速度、體外侵襲能力、細(xì)胞周期變化，并與MKN-45細(xì)胞株進(jìn)行比較。

7、 三、結(jié)果 1．NOD-SCID小鼠人肝癌原位移植模型于5w可捫及腫瘤的生長，成瘤率為100％，11w腫瘤體積為(4.484±0.93)cm<'3>,瘤重為(7.02±1.15)g，肺部轉(zhuǎn)移率為53.85％；裸小鼠人肝癌原位移植模型于6w～7w可捫及腫瘤的生長，成瘤率為100％，11w腫瘤體積為(1.02±0.70)cm<'3>，瘤重為(2.87±0.44)g，體內(nèi)未見轉(zhuǎn)移發(fā)生。NOD-SCID小鼠的瘤體積、瘤重、肺轉(zhuǎn)移

8、率均高于裸小鼠(P=0.000，P=0.000，P=0.011)。二者均保持AFP高分泌和γ-GT同工酶陽性的特性。 2.人肝癌HC-031皮下移植模型和原位移植模型由于腫瘤負(fù)荷過大分別于11w和6w而出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，荷瘤平均生存時(shí)間為75d和44d。病理解剖，皮下移植瘤模型未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移(0/7)，原位移植瘤模型的腫瘤和鄰近臟器侵襲明顯，部分出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移(2/7)。皮下切瘤動(dòng)物和肝原位切瘤動(dòng)物分別于17w和12w出現(xiàn)惡病質(zhì)現(xiàn)象，平均

9、生存時(shí)間為154d和112d。病理解剖發(fā)現(xiàn)肺部均有肉眼可見癌性轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(7/7，7/7)。未切瘤動(dòng)物和切瘤動(dòng)物血清中AFP和，γ-GTⅡ表達(dá)均為陽性。 3.人肺癌NCI-H460裸小鼠皮下移植瘤10w時(shí)瘤體嚴(yán)重壞死，并且動(dòng)物出現(xiàn)明顯消瘦，解剖未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。手術(shù)組裸小鼠于10w、12w各發(fā)現(xiàn)一例肺轉(zhuǎn)移(1/5)，14w時(shí)裸小鼠明顯消瘦，肺轉(zhuǎn)移率達(dá)100％(5/5)，有肉眼明顯可見的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，其他臟器未見轉(zhuǎn)移。免疫組化結(jié)果表明，MM

10、P-2、OPN、CD44v6、CD62和Timp-2在肺轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的表達(dá)明顯高于原發(fā)灶，CD54和MMP-9在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的表達(dá)則低于原發(fā)灶。 4.人胃癌原位移植模型MKN-45sci組動(dòng)物的肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)早且轉(zhuǎn)移率高，4w左右肉眼即可看到肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(100％)，同時(shí)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(100％)、肺轉(zhuǎn)移(71％)、脾轉(zhuǎn)移(29％)和腹水；移植瘤體積和重量明顯增加，分別達(dá)到(3089±1617)mm<'3>和(2.66±1.32)g，動(dòng)物出現(xiàn)

11、惡病質(zhì)。而4w時(shí)MKN-45組肝、肺、脾未見明顯轉(zhuǎn)移灶，僅2只動(dòng)物有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；小鼠未見明顯消瘦，移植瘤體積和重量為(275±90)mm<'3>和(0.35±0.14)g。MKN-45sci組血清中NSE和cYFRA21-1的濃度均較高，且隨著腫瘤生長時(shí)間的延長而增高。而MKN-45組CYFRA21-1始終呈現(xiàn)陰性，4w時(shí)NSE僅為76.9 ng/ml。免疫組化結(jié)果顯示MMP-9、OPN抗體在MKN-45sci組原位移植瘤和轉(zhuǎn)移灶呈強(qiáng)陽

12、性反應(yīng)，而在MKN-45組原位移植瘤反應(yīng)較弱。CD44v6抗體在MKN-45sci組原位移植瘤和轉(zhuǎn)移灶呈陽性反應(yīng)。E-cadherin抗體在MKN-45sci組原位移植瘤呈陽性反應(yīng)，肝轉(zhuǎn)移灶呈陰性反應(yīng)。建立的MKN-45mc細(xì)胞株的染色體為超三倍體細(xì)胞，具有人類惡性腫瘤細(xì)胞染色體的特點(diǎn)。細(xì)胞形態(tài)為典型的上皮樣細(xì)胞，與MKN-45的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)相似。流式細(xì)胞分析顯示MKN-45mc與MKN-45細(xì)胞周期各時(shí)相比例分別為：G<,0>-G<,1

13、>期62.51％/53.95％，S期9.46％/14.52％，G2。M期28·04％/31.53％，兩株細(xì)胞DNA合成期的細(xì)胞比例均較高。MKN-45mc與MKN-45細(xì)胞倍增時(shí)間分別為34.8h和42.1h，前者的生長速度高于后者。MKN-45mc與MKN-45的36h體外過膜數(shù)分別為(60.384±8.86)/高倍視野和(32.50±17.26)/高倍視野，前者多于后者。 四、結(jié)論 1.建立了與臨床表現(xiàn)相似的人肝癌動(dòng)

14、物模型。與裸小鼠相比，NOD-SCID小鼠在建立人肝癌的異種移植模型方面有更大的應(yīng)用價(jià)值。 2.模擬臨床腫瘤切除方法，建立人肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷瘤動(dòng)物腫瘤切除后，生存期延長，有利于腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生。 3.裸小鼠人肺癌術(shù)后轉(zhuǎn)移模型模擬了臨床腫瘤根除術(shù)后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的過程，結(jié)果提示肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生可能與部分粘附分子的異常表達(dá)相關(guān)，同時(shí)為研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制和術(shù)后抗轉(zhuǎn)移治療提供理想的動(dòng)物模型。 4.人胃癌原位移