HIV-1 DNA疫苗中試生產(chǎn)工藝研究及PTD-P24重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化.pdf

1、DNA疫苗是繼傳統(tǒng)疫苗和基因工程蛋白亞單位疫苗之后的新一代疫苗，質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備技術(shù)對DNA疫苗的產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。論文第一部分從我國重大科研課題的需求以及生物制藥行業(yè)發(fā)展的前景出發(fā)確立了HIV-1DNA疫苗中試生產(chǎn)工藝研究課題。在上下游研究、生產(chǎn)和質(zhì)控人員的配合下，經(jīng)過不懈努力，比較順利的完成了課題任務(wù)?；趯?shí)驗(yàn)室小試工藝研究的基礎(chǔ)之上，在GMP條件下，成功地實(shí)現(xiàn)了DNA疫苗生產(chǎn)工藝的放大，建立了有自主知識產(chǎn)權(quán)的臨床用DNA疫苗

2、制備工藝。穩(wěn)定了75L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，發(fā)酵20小時(shí)后收獲菌體約60g濕菌體/L，質(zhì)粒產(chǎn)量≥60mg/L。在確保高密度培養(yǎng)的前提下實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒的高產(chǎn)量。通過組合多種質(zhì)粒DNA純化手段并優(yōu)化各種參數(shù)，建立了穩(wěn)定、簡單、易放大的DNA疫苗中試純化工藝。運(yùn)用LiCl沉淀和精胺沉淀等粗純手段把絕大多數(shù)雜質(zhì)成分消滅在大容量、低成本的粗純階段。在做好粗純的基礎(chǔ)上盡可能減少昂貴費(fèi)時(shí)的層析工藝步驟，簡化整個(gè)流程。DNA疫苗純化工藝開發(fā)較好地貫徹了“

3、強(qiáng)化提取、簡化精制”的指導(dǎo)原則，生產(chǎn)出了符合臨床應(yīng)用要求的DNA疫苗制品，總體質(zhì)粒收率大于40％。與國外工藝相比，該工藝減少了精制工藝步驟、縮短了純化周期，降低了生產(chǎn)成本。另外，我們還建立了一套完整的產(chǎn)品質(zhì)量控制體系，以確保生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。HIV-1DNA疫苗成品經(jīng)中國藥品生物制品檢定所檢定，所有檢定指標(biāo)均符合臨床用DNA疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將用于我國艾滋病疫苗的臨床試驗(yàn)。 現(xiàn)有的蛋白亞單位疫苗的一個(gè)主要缺點(diǎn)是不能有效地誘

4、導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，本課題第二部分的研究思路是利用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(proteintransductiondomain，PTD)把目的蛋白導(dǎo)入細(xì)胞以探討增強(qiáng)細(xì)胞免疫的可能性。利用HIV的TAT蛋白所攜帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域編碼序列，使用PCR方法在HIV-1CN54p24基因的5’端融合了TAT基因序列，構(gòu)建PTD-P24融合基因。使用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，插入pThioHisA表達(dá)載體，構(gòu)建了pThioHisA-PTD-P2

5、4質(zhì)粒。實(shí)際上同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)含有pThioHisA-PTD載體，使用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后可以很方便的插入另一個(gè)基因，進(jìn)行其他研究。優(yōu)化表達(dá)條件在搖瓶中實(shí)現(xiàn)了非融合蛋白PTD-P24在大腸桿菌中的可溶性高效表達(dá)，SDS-PAGE顯示PTD-P24蛋白表達(dá)量達(dá)到菌體總蛋白達(dá)的45％。Western-blot實(shí)驗(yàn)表明目的蛋白具有良好的抗原性。采用弱陽離子交換層析純化PTD-P24蛋白，純度達(dá)到95％以上，此純化策略易放大，步驟簡便，