基因免疫制備乙肝X蛋白抗體及肝細(xì)胞癌患者血清中X蛋白檢測(cè).pdf

1、目的： 1．構(gòu)建含有完整乙型肝炎病毒X基因序列的基因疫苗并用該疫苗免疫BALB／c小鼠制備抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗體。 2．鑒定抗乙型肝炎病毒X蛋白的抗體的特異性并初步判斷其效價(jià)后，用該抗體檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者血清中X蛋白，同時(shí)對(duì)X蛋白陽(yáng)性患者血清中X基因進(jìn)行檢測(cè)。 方法： 1．基因疫苗的構(gòu)建：用PCR法從含有HBV X基因的原核表達(dá)載體pET-25b(+)-HBV X擴(kuò)增含完整X基因的重組x基因片段，插入真

2、核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，轉(zhuǎn)化受體菌DH5α，酶切及測(cè)序證實(shí)。 2．基因免疫制備抗體：用質(zhì)粒提取試劑盒大量制備基因疫苗。于BALB／c小鼠的大腿肌肉內(nèi)注射100μg基因疫苗做初次免疫，并在第19，29，39及49天用相同劑量做加強(qiáng)免疫。證實(shí)免疫成功后在產(chǎn)生最大抗體滴度時(shí)摘眼球取血并分離保存血清。 3．抗體特異性鑒定及效價(jià)判斷：每次免疫前一天和最后一次免疫后第2、4、6、8周經(jīng)小鼠尾靜脈取血分離血清。將原核表達(dá)載體

3、抽提純化后，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組x蛋白，用該蛋白鑒定血清中的抗體特異性并初步判斷其效價(jià)。 4．肝細(xì)胞癌患者血清中X蛋白的檢測(cè)：用基因免疫制備的抗體作為一抗、以western Blot法檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者血清中x蛋白。 5．HBx陽(yáng)性患者血清中X基因的檢測(cè)：用X蛋白(HBx)檢測(cè)陽(yáng)性患者血清中提取的DNA作為模板，以PCR法檢測(cè)血清中x基因。 結(jié)果： 1．構(gòu)建的基因疫苗．pc

4、DNA3.1(+)-HBV X經(jīng)用限制性核酸內(nèi)切酶酶譜分析、DNA序列測(cè)定等方法證實(shí)含有完整的HBV X基因序列。 2．利用原核表達(dá)的重組X蛋白作為抗原，檢測(cè)到經(jīng)基因免疫后小鼠血清中的抗X蛋白抗體，該抗體特異性良好，其最大抗血清滴度為100左右。 3．利用該抗體檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者血清中的X蛋白，檢出率為17.5％(7／40) 。 4．HBx檢測(cè)陽(yáng)性者血清中均能擴(kuò)增出約470bp大小的X基因片段。 結(jié)論：