寡聚半乳糖醛酸對(duì)云南紅豆杉細(xì)胞紫杉醇生物合成的誘導(dǎo)研究.pdf

1、紫杉醇是紅豆杉屬植物活性紫杉烷類次生代謝產(chǎn)物的代表之一，是具有獨(dú)特作用機(jī)制的有效抗癌新藥，10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deaeety1 baecatin Ⅲ，10-DABⅢ)則為紫杉醇的合成前體，同時(shí)自身亦具有生物活性。然而兩者的來源緊缺，目前采用離體培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)紫杉烷類活性成分已成為研究熱點(diǎn)。應(yīng)用植物對(duì)生物誘導(dǎo)物的超敏反應(yīng)機(jī)理，本文以寡聚半乳糖醛酸(Oligogalacturonides，OGA)為誘導(dǎo)物，研究其對(duì)云南紅豆杉(

2、Taxus yunnanensis Cheng et L．K．Fu．)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中紫杉醇及10-DABⅢ產(chǎn)量的調(diào)控，并對(duì)誘導(dǎo)的機(jī)制作了初步探討。 首先，建立了同步測定云南紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇和10-DABⅢ含量的HPLC方法，在232衄檢測波長下以甲醇-乙腈-水(2：3：8)為流動(dòng)相等度洗脫，10-DABⅢ得到良好的分離，在0.0515～2.06μg與峰面積線性關(guān)系良好，方程Y=89.146X+27.067(R2=0.9996)

3、，細(xì)胞及培養(yǎng)液供試品平均回收率分別為94.96％、100.72％，RSD分別為0.44％、O．81％。本方法簡便可靠，重現(xiàn)性好，靈敏度高。 應(yīng)用果膠酶處理多聚半乳糖醛酸，制備細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)物。多聚半乳糖醛酸在室溫下酶解20 min，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸，再經(jīng)Sephadex G-10(Mw≥700)柱處理，制備得到平均聚合度為13.231的OGA誘導(dǎo)子。 為明確OGA對(duì)云南紅豆杉細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)條件，以紫杉醇及10

4、-DABⅢ產(chǎn)量為目標(biāo)，分別對(duì)OGA誘導(dǎo)子的最佳處理時(shí)間、最佳處理濃度，及細(xì)胞的最佳收獲時(shí)間等方面進(jìn)行考察，篩選出OGA誘導(dǎo)最佳條件為：40μg/mL OGA處理懸浮培養(yǎng)至第12天的云南紅豆杉細(xì)胞，處理后第3天收獲細(xì)胞，紫杉醇及10-DAB M產(chǎn)量可分別達(dá)到O．51 mg／L及0.98 mg／L，與對(duì)照組(O．13 mg／t,及O．27 mg/L)相比分別增加了2.92與2.62倍，表明OGA是誘導(dǎo)云南紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇及10-DABⅢ的

5、較佳誘導(dǎo)子。 對(duì)OGA誘導(dǎo)下云南紅豆杉細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了探討。通過AO／EB染色法、TUNEL法、DNA梯狀電泳等方法證實(shí)OGA可誘導(dǎo)云南紅豆杉細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡AO／EB染色法計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)隨著OGA誘導(dǎo)時(shí)間的延長，凋亡細(xì)胞增多，在處理24 h后凋亡率達(dá)到28.5％。TUNEL法檢測顯示細(xì)胞凋亡程度隨OGA誘導(dǎo)時(shí)間的延長呈現(xiàn)增多趨勢。DNA梯狀電泳圖譜表明了OGA誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞第3天產(chǎn)生了梯狀條帶，細(xì)胞發(fā)生了大量凋亡。

6、 對(duì)OGA誘導(dǎo)下云南紅豆杉細(xì)胞的氧化還原態(tài)勢變化進(jìn)行了分析。OGA可誘導(dǎo)云南紅豆杉細(xì)胞以H202為主的活性氧進(jìn)發(fā)并影響到紫杉烷類次生代謝物的產(chǎn)量變化。OGA可誘導(dǎo)云南紅豆杉細(xì)胞1.5～2 h H2O2達(dá)到分泌高峰(17.95 μuol/L)，H202分泌迅速增加而持續(xù)時(shí)間相對(duì)較短(約2 h)。同時(shí)，經(jīng)OGA處理后，超氧化物歧化酶(SOD)在2 h出現(xiàn)了高峰值，與此同時(shí)過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)則受到了強(qiáng)烈的抑制，多

7、酚氧化酶(PPO)活性同樣得到提高。紅豆杉細(xì)胞經(jīng)OGA處理后，苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PAL)活性明顯升高，第2 d達(dá)到峰值(39.01U/h mg proteill)，用CAT與二苯基碘(DPI)分別直接、間接抑制H202的產(chǎn)生，與OGA誘導(dǎo)組相比，PAL活性與紫杉烷類產(chǎn)量則受到了顯著的抑制。細(xì)胞內(nèi)維持一定水平H202是云南紅豆杉細(xì)胞紫杉醇及10-DABⅢ生物合成的一個(gè)重要因素，H202為主的ROS進(jìn)發(fā)致使細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引起紫杉醇及10-DA