栽培南方紅豆杉紫杉醇分析提取與指紋圖譜研究.pdf

1、南方紅豆杉(taxuschinensisvar．mairei)，又稱美麗紅豆杉，為裸子植物門(Gymnospermae)紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物。為紅豆杉屬植物中分布最廣泛的一種，主要分布于長江流域、南嶺山脈山區(qū)及河南、陜西、甘肅、臺(tái)灣等省的山區(qū)或溪谷，它是亞熱帶常綠闊葉林、常綠落葉闊葉混交林的特征種，常與其他闊葉樹、竹類以及針葉樹混生，分布于海拔800～1600米，資源儲(chǔ)量相對較紅豆杉其它各種多。自197

2、1年從紅豆杉中分離出紫杉醇后，它已成為研究抗腫瘤天然藥物的重點(diǎn)，南方紅豆杉更成為我國紫杉醇藥物生產(chǎn)的主要樹種。 南方紅豆杉中紫杉醇含量甚微，其含量范圍僅僅在0.003％～0.008％之間，含有大量的植物臘、色素和樹膠等雜質(zhì)，特別是其中共存許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)與紫杉醇極其相近的紫杉烷系列化合物，而這些成分會(huì)嚴(yán)重干擾紫杉醇的反相高效液相色譜法(RP—HPLC)測定。為了能準(zhǔn)確測定紫杉醇含量，試驗(yàn)優(yōu)選了RP—HPLC測定紫杉醇含量的

3、色譜條件，即：用SHIMADZUC18色譜柱(250mm×4.6mmID，5μm)；甲醇—水—乙腈(22：32.5：45.5)為流動(dòng)相，紫外檢測波長為227nm。紫杉醇對照品溶液濃度在0.0004376mg.mL-1～0.004376mg.mL-1范圍內(nèi)，線性方程為：Y=2.152968×107X+1773(r=0.9999)(n=5)；相關(guān)系數(shù)r=0.9999(n=5)時(shí)，與峰面積線性關(guān)系良好；通過檢測限(紫杉醇進(jìn)樣量為0.00105

4、0μg時(shí))和定量限(紫杉醇進(jìn)樣量為0.003501μg時(shí))，確定了紫杉醇對照品溶液最小濃度也符合RP—HPLC的檢測要求。對南方紅豆杉人工林材樣品制備優(yōu)化處理如下：將采集的南方紅豆杉整株樣品干燥，用6倍量(W/V)的乙醇浸提兩次，合并提取液，減壓濃縮至干；再用6倍量(W/V)的二氯甲烷液液萃取三次，合并萃取液，減壓濃縮至干，殘?jiān)由V甲醇溶解，制成南方紅豆杉樣品溶液；用加樣回收方法考察了該方法的可行性。同時(shí)隨機(jī)采集了10批南方紅豆杉藥材

5、樣品，進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的RP—HPLC檢測紫杉醇含量方法的可行性，結(jié)果表明該方法快速、簡便、可靠，重現(xiàn)性好，能作為人工種植南方紅豆杉中紫杉醇含量檢測方法。 在對重慶市忠縣的南方紅豆杉人工林材各部位紫杉醇含量變化規(guī)律研究過程中，以紫杉醇含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)，通過4因素5水平交表(L16(45))，對南方紅豆杉影響因素年齡、季節(jié)(以隨機(jī)選取各季節(jié)的一個(gè)月份作為代表)、不同部位3因素進(jìn)行了優(yōu)選試驗(yàn)。結(jié)果表明：南方紅豆杉中紫杉醇含量

6、主要影響因素是年齡，其次是不同部位，采收季節(jié)對紫杉醇的含量影響也是顯著的；通過多重比較，確定T9(A3B1C4)效果最好，即在1月份時(shí)采用6年生人工種植南方紅豆杉葉，為優(yōu)化選出的紫杉醇最佳采集時(shí)機(jī)，再結(jié)合紅豆杉生產(chǎn)實(shí)際情況，采集6年生的枝葉作為紫杉醇的試驗(yàn)對象。 干燥方法對南方紅豆杉中紫杉醇含量的影響研究中，采用自然風(fēng)干、減壓干燥和微波干燥3種干燥方法，綜合各干燥方法中的不同干燥條件，試驗(yàn)結(jié)果表明：減壓干燥宜選用60℃；微波干燥

7、低火；而自然風(fēng)干和其它干燥方法可能造成紫杉醇顯著降解，均不宜取。 優(yōu)化并建立紅豆杉枝葉中紫杉醇的提取工藝，充分考慮了工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。以使用RP—HPLC測定的紫杉醇含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對提取過程中乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間4因素進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn)。結(jié)果表明：從紅豆杉中提取紫杉醇的最主要影響因素是乙醇濃度及乙醇用量，高濃度、適當(dāng)多的用量有利于提取；提取時(shí)間和次數(shù)也極為重要；單因素效果分別以每次提取2h和共提取2次為

8、最佳。最終T9(A3B3C2D1)和T8(A3B2C1D3)，即采用8倍量(W/V)95％乙醇提取2次，每次提取2小時(shí)，或采用6倍量(W/V)95％乙醇提取1次，提取4小時(shí)，均為優(yōu)化選出的紫杉醇最佳提取工藝條件。 在中藥的開發(fā)過程中，色譜指紋圖譜研究工作是國內(nèi)中藥現(xiàn)代化研究的熱點(diǎn)之一，為中藥材建立相應(yīng)的指紋圖譜是現(xiàn)階段控制中藥內(nèi)在質(zhì)量的有效手段。試驗(yàn)中共收集到人工種植南方紅豆杉枝葉藥材11批、研究過程中考察了色譜條件的優(yōu)化，包括

9、色譜柱、檢測波長和流動(dòng)相的優(yōu)化選擇；同時(shí)參照國家食品藥品監(jiān)督管理局對中藥材指紋圖譜的要求，對色譜條件進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，即儀器精密度試驗(yàn)、樣品重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)；在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了色譜指紋圖譜，包括：共有峰的標(biāo)定、參照峰的選擇、共有峰相對保留時(shí)間及積分相對比值的確定、非共有峰占總峰面積的百分比、共有峰的相似度計(jì)算，色譜條件的優(yōu)化結(jié)果表明，選用C18柱，檢測波長為227nm，以乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，為最佳色譜條件。 根據(jù)色譜條

10、件的優(yōu)化結(jié)果，對儀器精密度、樣品重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)，高效液相色譜測定結(jié)果中，共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD都小于3.0％，表明采用高效液相色譜法進(jìn)行色譜指紋圖譜的研究是切實(shí)可行。通過色譜指紋圖譜的構(gòu)建，確定了17個(gè)共有峰，以9號峰作為參照峰；共有峰相對保留時(shí)間和相對峰面積的平均RSD都小于2.0％，說明試驗(yàn)結(jié)果可靠；共有峰面積百分比在4.1％～8.3％，符合指紋譜研究規(guī)定小于10％的檢測要求；采用相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法對共有