南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)及其紫杉醇含量調(diào)控的優(yōu)化研究.pdf

1、南方紅豆杉(Taxus chinensis vat.mairei)，為紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)在中國的1個(gè)變種，其枝、皮、葉、根和果肉中均含有抗癌藥物紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)。為了利用南方紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇，本研究采用HPLC、正交實(shí)驗(yàn)、愈傷組織直徑測(cè)量、稱重等方法，對(duì)南方紅豆杉嫩莖、較成熟幼莖皮、形成層組織、嫩葉、頂端分生組織5種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、培養(yǎng)基優(yōu)化、愈傷組織

2、生長和紫杉醇生物合成量調(diào)控的優(yōu)化等進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。結(jié)果顯示： 愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)基以MS+1.2mg/L2,4-D+4mg/LNAA+2.8mg/L6-BA為佳，外植體以嫩莖和頂端分生組織最佳，其次為幼葉。愈傷組織生長增殖的優(yōu)化培養(yǎng)基為B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/L NAA+0.1 mg/L KT和B5+0.4 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.8 mg/L。KT。有利于愈傷組織生產(chǎn)紫

3、杉醇的培養(yǎng)基為：B<,5>+0.8 mg/L2，4-D+2.Omg/L NAA+0.2 mg/L KT+0.1 mg/L CH。即有利于愈傷組織生長又有利于生產(chǎn)紫杉醇的培養(yǎng)基為B<,5>+1.2 mg/L 2,4-D+3.2 mg/LNAA+0.1 mg/L KT+0.1 mg/L CH(生長率為3.24倍/周期，1個(gè)周期約為45 d～50 d，紫杉醇含量為0.0187％)。在5種外植體中，嫩莖和葉愈傷組織合成紫杉醇的能力較其它愈傷組織

4、強(qiáng)。 采用杜仲綠原酸調(diào)控，以加快愈傷組織生長為目的時(shí)應(yīng)選擇生長初期愈傷組織。以增加愈傷組織中紫杉醇產(chǎn)量為目的時(shí)則選擇生長旺盛期或生長停滯期愈傷組織，前者在培養(yǎng)基中加入1 mg/L左右95％的杜仲綠原酸可使愈傷組織中紫杉醇的含量達(dá)到0.0658％，是該組最低樣的100倍；后者紫杉醇的含量呈隨綠原酸濃度的增加而不斷增加的趨勢(shì)，當(dāng)綠原酸加到10 mg/L時(shí)，愈傷組織中紫杉醇的含量達(dá)0.025％，是對(duì)照0.0058％的4.3倍。0.1

5、mg/L綠原酸+0.1mg/L水楊酸+1.7mg/L硝酸銀可誘導(dǎo)愈傷組織中紫杉醇含量達(dá)0.0735％，比對(duì)照(未能檢出紫杉醇的含量)提高近100倍。 采收后的愈傷組織用南方紅豆杉菌根真菌F進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化后，愈傷組織中紫杉醇的含量較對(duì)照提高15倍之多。這一過程對(duì)加入的菌液量、發(fā)酵轉(zhuǎn)化時(shí)間均較敏感。 過多、過長都會(huì)導(dǎo)致愈傷組織中紫杉醇含量的降低，以每20 g愈傷組織中加入10 mL菌液、發(fā)酵轉(zhuǎn)化0.5 d為佳。由南方紅豆杉外植

6、體來源的差異和培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑的差異所引起的愈傷組織生長量間的差異會(huì)因反復(fù)繼代培養(yǎng)被消除。有利南方紅豆杉愈傷組織生長的植物生長調(diào)節(jié)劑配方?jīng)]有唯一性。但不同調(diào)節(jié)劑濃度和組合作用下的同源愈傷組織中、相同調(diào)節(jié)劑作用下不同源愈傷組織中紫杉醇含量均存在著極顯著差異，適當(dāng)水平(2mg/L)的2,4-D單用，或與適當(dāng)水平的KT、6-BA、KT+GA配合使用，對(duì)南方紅豆杉愈傷組織紫杉醇的合成較有利，NAA則不太有利。 南方紅豆杉愈傷組織的

7、生長周期約為45d，延滯期約為5d，第6天到第35天為快速生長期，此后進(jìn)入穩(wěn)定期，約第50天后愈傷組織開始衰老、褐變。 2,4-D和NAA對(duì)愈傷組織的生長和紫杉醇的生物合成均存在交互作用，0.4 mg/L2,4-D+3.2 mg/L NAA對(duì)愈傷組織生長最為有利，0.8 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L NAA組合明顯有利于愈傷組織紫杉醇的生物合成。 CH不利于南方紅豆杉愈傷組織的生長。 南方紅豆杉愈傷組織

8、中具有較高含量的紫杉烷類化合物。 采用兩種觀測(cè)研究愈傷組織生長的方法所獲得的結(jié)果比較一致，說明兩種方法均可行。但愈傷組織直徑觀測(cè)法因避免了將愈傷組織取出觀測(cè)的一系列繁瑣的無菌操作過程而更簡(jiǎn)便、易行。 對(duì)生長初期愈傷組織，其生長速率隨綠原酸濃度的增加而加快，但紫杉醇含量反而下降。當(dāng)培養(yǎng)基中綠原酸濃度超過1.0 mg/L后，愈傷組織生長量就不再隨加入綠原酸量的增加而增加。 綠原酸使南方紅豆杉愈傷組織的顏色普遍比對(duì)照淺