影響紅豆杉細胞系穩(wěn)定生產(chǎn)紫杉醇的因素研究.pdf

1、紅豆杉細胞培養(yǎng)技術(shù)是解決紫杉醇藥源緊張的有效途徑之一。研究表明，不同培養(yǎng)方式和代謝調(diào)控方法能夠有效提高紅豆杉細胞合成紫杉醇的能力。但是，目前紅豆杉細胞培養(yǎng)仍然沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，其最重要的原因在于紅豆杉細胞在培養(yǎng)過程中不能穩(wěn)定合成紫杉醇。本論文從細胞水平和分子水平兩個方面探討了影響紅豆杉細胞系穩(wěn)定性的因素，包括細胞均一性、溫度、培養(yǎng)基、去甲基化試劑和誘導(dǎo)子的添加，并建立了高效液相色譜法檢測基因組DNA甲基化水平。論文主要結(jié)果如下：

2、 1. 建立了一種紅豆杉愈傷組織高頻誘導(dǎo)的新方法：春季誘導(dǎo)愈傷組織，外植體分解成長約1 cm的帶葉柄莖段，MS培養(yǎng)基中添加0.25 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L NAA。新誘導(dǎo)的高產(chǎn)曼地亞紅豆杉細胞系，紫杉醇平均含量能夠達到400 μg/g細胞干重。 2. 探討了4 ℃低溫介導(dǎo)的紅豆杉細胞系穩(wěn)定傳代的工藝：低溫保存的紅豆杉細胞恢復(fù)培養(yǎng)后紫杉醇含量下降嚴重，二次低溫5-7天能夠有效地抑制紫杉醇含量的下降。而低溫加熱激后

3、添加誘導(dǎo)子可以將紫杉醇含量提高到132.2 μg/g，比單純誘導(dǎo)時提高了2.16倍。 3.系統(tǒng)研究了不同培養(yǎng)條件對曼地亞紅豆杉細胞系穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明，激素水平對紅豆杉細胞系的穩(wěn)定性影響較大，其次是培養(yǎng)基的種類和培養(yǎng)周期，培養(yǎng)方式的影響基本可以忽略。在不均勻的培養(yǎng)體系中，高產(chǎn)細胞的比例占到40％左右時，紫杉醇產(chǎn)量將達到最大。 4. 研究了紅豆杉細胞中DNA甲基化水平改變對紫杉醇含量的影響。結(jié)果表明，添加1 mg/L

4、去甲基化試劑5-Aza-CdR處理12天能夠在不顯著抑制細胞生物量積累的同時，有效提高紫杉醇含量。去甲基化試劑對中國紅豆杉細胞的生長抑制作用更為強烈，對紫杉醇含量的提高也更為明顯。和誘導(dǎo)子協(xié)同作用時能使曼地亞紅豆杉細胞中的紫杉醇含量達到362.2 μg/g，比對照提高了6.19倍；而中國紅豆杉細胞中紫杉醇含量能夠提高到對照組的8.16倍。 5. 建立了一套適合紅豆杉細胞基因組DNA甲基化檢測的高效液相色譜法，通過重復(fù)試驗證明此方