穿通支原體誘發(fā)IgA腎病的實驗研究.pdf

1、穿通支原體(Mycoploama penetrans,M.penetrans)是首次從艾滋病(AIDS)患者尿中分離檢出的一種新的致病性支原體,繼之,1999年Yfihez從原發(fā)性抗磷脂綜合征病人的體液中分離到穿通支原體.本文的研究曾發(fā)現(xiàn)在IgA腎病患者的血液、尿液、咽拭子中Mpenetrans有很高的分離率.本研究旨在建立穿通支原體誘發(fā)的IgA腎病動物模型,試圖證實穿通支原體感染在IgA腎病發(fā)病機理中的作用. 方法：1.菌株來

2、源溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科病理室腎活檢病理診斷原發(fā)性IgA腎病患者血中分離培養(yǎng)的M.penetrans菌株,并經(jīng)核酸序列分析鑒定的陽性M.penetrans菌株(HF-2)轉(zhuǎn)種M.penetrans液體分離培養(yǎng)基擴大再培養(yǎng)至對數(shù)生長期菌液(10<'7～8>). 2.實驗動物 清潔級健康ICR雌性小鼠,4周齡,45只,體重18～22克,溫州醫(yī)學院動物實驗中心提供. 3.免疫抑制狀態(tài)小鼠的制備隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺

3、50mg/kg/d,5次制成免疫抑制模型. 4.IgA腎病模型的制備用對數(shù)生長期M.penetrans菌液采用不同的給藥方式,在ICR小鼠中誘發(fā)IgA腎病,實驗動物在3,5,7,9,11,13周分批宰殺,取肝腎組織做IgA免疫熒光,光鏡及電鏡檢查. ①生理鹽水對照組7只,腹腔注射生理鹽水0.1ml,每周2次,共3周,正常飼喂直到13周; ②培養(yǎng)基對照組7只,穿通支原體培養(yǎng)基與等量的完全弗氏佐劑研磨混和,腹腔注射0

4、.1 ml,余同①組; ③M.penetrans腹腔注射組9只,56℃30分鐘滅活的對數(shù)生長期的支原體菌液與等量的完全弗氏佐劑研磨混和,腹腔注射0.1 m1,余同①組. ④免疫抑制腹腔注射組11只,首先隔日腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg/d,5次制成免疫抑制模型,余同③組; ⑤免疫抑制上行感染組11只, 同④組制成免疫抑制模型,取對數(shù)生長期的支原體菌液泌尿道上行感染0.1ml,余同①組. 5.實驗動物血培

5、養(yǎng)及M.penetrans再培養(yǎng)各組小鼠進行血液普通培養(yǎng)以排除血液其他細菌的感染,①生理鹽水對照組與⑤免疫抑制上行感染組并進行血液及其組織的.M.penetrans再培養(yǎng). 6.IgA免疫熒光檢查將速凍的實驗小鼠肝,腎組織切成5μm的冰凍切片,用FITc標記的羊抗小鼠IgA 血清,直接法進行染色.在雙盲情況下觀察腎小球及肝臟IgA的沉積情況,用半定量法描述熒光強度,記錄分布. 7.光鏡觀察 腎臟標本分別用HE,P

6、AS,PASM,masson四種染色,觀察腎組織形態(tài)學變化及在特殊染色下有無沉積物. 8.腎小球形態(tài)定量分析每只小鼠觀察30個腎小球進行定量分析. (1)腎小球細胞數(shù)(不計數(shù)球囊壁層上皮細胞). (2)腎小球直徑(測量腎小球橫徑和縱徑相乘后開方得封一個平均直徑). 9.電鏡標本的制作與觀察分別取各組小鼠腎經(jīng)2.5﹪戊二醛和1﹪鋨酸雙重固定,丙酮梯度脫水,Epon-812環(huán)氧樹脂包埋,RMC-PT超薄切片機

7、切片,半薄切片光鏡定位于腎組織實質(zhì)細胞部分,超薄切片經(jīng)鉛一鈾雙重染色,H-7500透射電鏡下觀察,拍片. 10.統(tǒng)計學處理采用Fisher確切概率法和t檢驗處理. 結(jié)果： 1.實驗動物血培養(yǎng)及M.penetrans再培養(yǎng)①～⑤組血培養(yǎng)未見肉眼可見細菌生長;⑤免疫抑制上行感染組血、腎臟組織和膀胱組織培養(yǎng)M.penetrans陽性. 2.免疫熒光檢查2.1肝臟各組肝細胞周圍未發(fā)現(xiàn)明顯的IgA沉積. 3

8、.光鏡觀察除①組外,其它各組小鼠均可見腎小球基質(zhì)增多伴有細胞增生,腎小囊腔變窄,基底膜增多增厚,病變程度以輕度為主,僅累及部分腎小球.個別小鼠可見有細胞性新月體形成.IgA陽性小鼠在masson染色下可見系膜區(qū)染成紅色的蛋白沉積物.腎小球定量分析觀察,IgA陽性小鼠腎小球細胞數(shù)明顯增加,腎小球體體積增大,與IgA陰性小鼠比較差異具有顯著性(t=2.48,P＜0.05). 4.電鏡觀察IgA免疫熒光陽性的腎組織均可見系膜區(qū)云絮狀電

9、子致密物沉積,系膜基質(zhì)增多不明顯,可見系膜細胞輕度增生.基底膜均勻,可見節(jié)段性足突融合.IgA免疫熒光陰性的腎組織未見電子致密物. 結(jié)論：1.穿通支原體誘發(fā)IgA腎病動物模型的建立,不但在光鏡下觀察到相應病理改變、免疫熒光提示腎系膜區(qū)羊抗鼠.lgA抗體的沉積,并在電鏡下證實IgA腎病病理改變(IgA抗體的沉積),提示穿通支原體具有誘發(fā)IgA腎病潛在致病性. 2.IgA腎病的發(fā)病不僅和穿通支原體感染有關(guān),并與自身的免疫因素