EGFP-EGF1蛋白結(jié)合隱形納米粒的腦血栓靶向遞藥研究.pdf

1、腦血栓性疾病以極高的致死率、致殘率危害著人們的健康，但現(xiàn)行的治療中全身給藥伴隨著很高的出血意外，介入治療雖然有針對性但是存在著較高的手術(shù)風(fēng)險、較高的再梗塞率和較窄的適用人群。靶向給藥，通過全身給藥的方式就能像介入一樣在局部形成高濃度，同時回避了手術(shù)風(fēng)險；因為大大降低了全身給藥量又最大程度地控制了出血風(fēng)險，因而具有極大的研究價值。
　　 眾所周知，組織因子（TF）在整個凝血瀑布中扮演了扳機點的角色；而對于急性心、腦血管事件，血管損

2、傷所釋放的TF與血液中的凝血因子Ⅶ（FⅦ）特異性結(jié)合是重要的始動因素。FⅦ與TF 結(jié)合的部位主要位于類表皮因子一區(qū)（EGF1）和SP 區(qū)，EGF1 可以與TF 特異性結(jié)合但是沒有促凝血活性，因此在前期研究中我們基于大鼠FⅦ的EGF1 區(qū)的結(jié)構(gòu)制備了EGFP-EGF1融合蛋白，并對其與TF的結(jié)合功能做了一系列研究。研究表明將EGFP-EGF1 蛋白作為靶向功能基連接在聚乙二醇-聚乳酸（PEG-PLA）納米粒的表面，能明確靶向到TF表達部位

3、，在體內(nèi)、外試驗中均得到驗證。
　　 由于采用聚乳酸-聚羥基乙酸（PLGA）制備的納米粒比PLA納米粒具有更高的基因轉(zhuǎn)染效率，于是本研究采用PEG-PLGA 作為聚合物材料制備納米粒，以EGFP-EGF1作為靶向性頭基，與之共價連接制備了新型的藥物遞送系統(tǒng)—EGF1-EGFP-NP。該納米粒以受體介導(dǎo)的方式增加其腦梗塞部轉(zhuǎn)運，將該生物可降解的納米粒作為藥物的載體，不僅安全性好，還能顯著提高藥物的穩(wěn)定性和輸送能力；納米粒采用復(fù)乳/

4、溶媒蒸發(fā)法制備，適合于包載水溶性大分子藥物，比如蛋白、多肽和基因藥物，可以掩蓋其自身的理化性質(zhì)，代之以納米粒的特性；納米粒表面經(jīng)過PEG 修飾，可以避免單核巨噬系統(tǒng)的吞噬，延長在血漿中的半衰期，提高藥時曲線下面積（AUC），具有長循環(huán)作用。
　　 第一部分為EGF1-EGFP-NP的制備與表征，它是通過復(fù)乳/溶媒蒸發(fā)法將馬來酰胺亞胺封端的聚乙二醇-羥基乙酸共聚物（Maleimide-PEG-PLGA）和單甲氧基聚乙二醇乳酸-羥基

5、乙酸共聚物（MPEG-PLGA）按照1：10的比例混合制備NP，并通過表面的Maleimide-PEG與巰基化的EGFP-EGF1 蛋白共價結(jié)合而成。該納米粒的平均粒徑為100 nm 左右形態(tài)圓整、規(guī)則，Zeta 為-15mV 左右。免疫電鏡觀察結(jié)果證實納米粒子表面共價結(jié)合有EGFP-EGF1，并計算出表面連接的蛋白數(shù)目為112±7個。
　　 第二部分制備了高純度的原代大鼠BCEC，用TNF-α成功復(fù)制了BCEC表達TF的細胞模

6、型。以6-香豆素作為熒光探針，對EGF1-EGFP-NP的BCEC 內(nèi)遞藥特性進行了評價，結(jié)果表明6-香豆素在NP和EGF1-EGFP-NP中24 h 內(nèi)的體外滲漏率低于3.62％，能準確示蹤其體內(nèi)外的生物學(xué)行為。BCEC 對納米粒的攝取結(jié)果表明，異常表達TF的BCEC 對EGF1-EGFP-NP的攝取存在TF與EGF1 結(jié)合介導(dǎo)的攝取增強效應(yīng)。細胞活力測定結(jié)果顯示，EGF1-EGFP-NP與NP 比較，其IC20和IC50 均無顯著性

7、差異，證實了EGF1-EGFP-NP 具有良好的生物安全性。通過以上體外實驗證明，EGF1-EGFP-NP是一種具有TF 介導(dǎo)的遞藥特性且毒性較低的藥物傳遞系統(tǒng)。
　　 第三部分以光化學(xué)法復(fù)制的大鼠皮質(zhì)微血栓模型為基礎(chǔ)，首先以6-香豆素為熒光探針通過藥動學(xué)的方法研究了EGF1-EGFP-NP的腦內(nèi)遞送特點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGF1-EGFP-NP與NP相比其腦血栓部位的靶向指數(shù)為2.58；組織分布的結(jié)果表明肺臟和腎臟的分布有所增加，肝臟

8、有所降低。通過以Dir為熒光探針進行活體與器官成像結(jié)果表明，在對應(yīng)腦血栓照射部位，各時間點EGF1-EGFP-NP表現(xiàn)的熒光強度都高于NP，通過器官成像及定量分析發(fā)現(xiàn)1 h、4 h和24 h在腦血栓形成部位EGF1-EGFP-NP的濃度為NP的兩倍以上，其中以1 h時最高，為2.66倍。腦組織微觀和超微水平觀察結(jié)果顯示，梗塞灶內(nèi)的EGF1-EGFP-NP基本分布在梗塞灶的血管內(nèi)，而且與局部表達的TF定位一致，這表明其有明確的TF靶向效能

9、。通過TEM觀察發(fā)現(xiàn)EGF1-EGFP-NP主要分布在血管內(nèi)皮細胞胞漿和細胞核內(nèi)，提示其能夠遞送藥物進入損傷的腦微血管內(nèi)皮細胞。急性毒性試驗結(jié)果表明，高劑量的EGF1-EGFP-NP不影響大鼠的凝血功能；吞噬細胞特異性染色顯示，高劑量的EGF1-EGFP-NP不引起SD大鼠腦、心臟和肝臟的急性炎癥反應(yīng)，僅對脾臟、肺臟和腎臟產(chǎn)生一過性的輕微毒性。因此，EGF1-EGFP-NP是具有一定的腦血栓靶向特性，而且毒性較低的遞藥系統(tǒng)。
　　

10、 為了實現(xiàn)對腦血栓性疾病的靶向治療，第四部分采用EGF1-EGFP-NP 作為靶向輸送的載體，構(gòu)建了包載NF κB TFD ODNs的藥物傳遞系統(tǒng)，并對其體內(nèi)外效能進行了初步評價。對該納米粒的表征結(jié)果表明，其粒徑為105.5±10.02 nm；Zeta 電位值為-17.23±1.49 mV；載藥量為0.23％；包封率為55.75％；納米粒的制備工藝未對ODNs的結(jié)構(gòu)造成破壞。通過CY3 標(biāo)記的ODNs和6-香豆素作為熒光探針，比較了表

11、達TF的BCEC 對EGF1-EGFP-NP-ODNs和NP-ODNs 攝取情況，結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)EGF1-EGFP-NP-ODNs的攝取明顯高于NP-ODNs，而且可以明顯觀察到ODNs 被轉(zhuǎn)運入細胞核。實時定量PCR結(jié)果顯示，EGF1-EGFP-NP-ODNs 能明顯降低TNF-α刺激的BCEC的TF mRNA的表達水平，效果明顯強于ODNs和NP-ODNs；通過Western blotting 結(jié)果顯示，EGF1-EGFP-NP-OD

12、Ns 能明顯降低TNF-α刺激的BCEC的TF 蛋白的表達水平，效果明顯強于ODNs和NP-ODNs。通過活體和器官成像，EGF1-EGFP-NP-ODNs在腦梗塞處的濃度為NP-ODNs的4 倍左右。造模結(jié)束后立即給藥，6 h 時與生理鹽水和NP-ODNs組相比，EGF1-EGFP-NP-ODNs組的TF表達明顯下降；24 h 時通過7.0 T MR 檢測發(fā)現(xiàn)，EGF1-EGFP-NP-ODNs組的梗死體積也明顯縮小，與生理鹽水和NP