犬半舌同種異體移植的初步研究.pdf

1、本課題采用Beagle犬進(jìn)行半舌同種異體移植，探討早期急性排斥反應(yīng)的特征和規(guī)律，建立觀察指標(biāo)和分級標(biāo)準(zhǔn)。同時，在實驗動物長期存活的基礎(chǔ)上，初步探討移植舌運(yùn)動功能的恢復(fù)情況，為今后深入研究各種功能恢復(fù)情況及進(jìn)行全舌移植奠定基礎(chǔ)。 研究內(nèi)容及目的： 1.應(yīng)用顯微外科技術(shù)建立Beagle犬半舌異體移植模型，探討舌同種異體移植的可行性，同時為移植后功能變化研究創(chuàng)造條件。 2.觀察急性排斥反應(yīng)的肉眼、HE及免疫組化特征，探

2、討其發(fā)生規(guī)律，在此基礎(chǔ)上，建立急性排斥反應(yīng)觀察指標(biāo)和分級標(biāo)準(zhǔn)，以便用于指導(dǎo)進(jìn)一步的動物實驗及臨床研究。 研究材料和方法： 1.半舌同種異體移植動物模型的建立8只購自中山大學(xué)實驗動物中心Beagle犬，體重10kg左右。選擇頭面部大小及體重相近、性別匹配的犬分別作為供受體，配成四對。供受體均采用全麻，保持生命體征平穩(wěn)的狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)。頸部切口找到頸外動靜脈、舌動靜脈、舌神經(jīng)及舌下神經(jīng)，向上分離至入舌處。再經(jīng)口內(nèi)切取右側(cè)半舌

3、。第二組人員同時準(zhǔn)備相同的手術(shù)，取下后交換犬的右側(cè)半舌，分別縫合于缺損處。然后進(jìn)行血管神經(jīng)吻合，最后縫合頸部傷口，放置引流管或引流條。配對犬隨機(jī)分為兩組，一組不用免疫抑制劑(對照組，a組)，另一組使用免疫抑制劑(實驗組，b組)。術(shù)后觀察移植半舌的大體情況，生存狀況，對存活3個月動物的舌下神經(jīng)進(jìn)行電生理檢測。 2.半舌移植急性排斥反應(yīng)的特征觀察利用第一部分建立的動物模型，a組動物進(jìn)行排斥反應(yīng)的觀察，術(shù)后每天數(shù)次觀察移植半舌的顏色、

4、溫度、質(zhì)地及活動情況。分別于術(shù)后1、3、5、7天選取活檢標(biāo)本，HE染色觀察。建立排斥反應(yīng)大體和光鏡的觀察指標(biāo)和分級標(biāo)準(zhǔn)，確立排斥反應(yīng)發(fā)生的時間和嚴(yán)重程度。b組動物根據(jù)實際情況選取活檢標(biāo)本，觀察是否發(fā)生排斥反應(yīng)。 利用上述活檢所得標(biāo)本，10％福爾馬林浸泡后制作石蠟切片，免疫組化觀察GrB(GranzymeB)在移植舌組織中的表達(dá)情況。另一份標(biāo)本液氮迅速凍存，RT-PCR檢測PFP(Perforin)/GrB的表達(dá)情況。觀察PFP/

5、GrB表達(dá)與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 研究結(jié)果： 1.半舌同種異體移植動物模型的建立a組動物均發(fā)生了急性排斥反應(yīng)。b組動物中，Ⅰb號動物在術(shù)后11天出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的排斥反應(yīng)，移植半舌最終發(fā)生排斥；Ⅱb號動物術(shù)后7天發(fā)生可以逆轉(zhuǎn)的排斥反應(yīng)，術(shù)后31天因頸部感染而死亡；Ⅲb動物術(shù)后6天因感染控制不佳而死亡；Ⅳb號動物術(shù)后4天出現(xiàn)可逆轉(zhuǎn)的排斥反應(yīng)，而后情況穩(wěn)定，術(shù)后第100天進(jìn)行舌下神經(jīng)電生理實驗，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)功能部分恢復(fù)。

6、 2.半舌移植急性排斥反應(yīng)的特征觀察a組動物術(shù)后均發(fā)生了排斥反應(yīng)，大體觀察平均7.5天發(fā)生完全的排斥反應(yīng)，鏡下觀察平均6天發(fā)生完全的排斥反應(yīng)。按分級標(biāo)準(zhǔn)鏡下觀察平均2.75天發(fā)生Ⅰ級排斥反應(yīng)，4.25天發(fā)生Ⅱ級排斥反應(yīng)。b組動物中，有3只發(fā)生急性排斥反應(yīng)，其中2只經(jīng)加大環(huán)孢素和強(qiáng)的松劑量恢復(fù)了正常，另1只恢復(fù)不佳移植物最終排斥。 由a組動物可知，GrB可以在排斥反應(yīng)中表達(dá)，而且，在大體觀察未發(fā)現(xiàn)排斥反應(yīng)時即可見到其表達(dá)，HE病理

7、觀察分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的標(biāo)本中有GrB蛋白及PFP/GrB基因表達(dá)，但在Ⅳ級時則未見表達(dá)。 研究結(jié)論： 1.采用非同胞Beagle犬進(jìn)行半舌同種異體移植是可行的。先使用CSA大劑量沖擊再小劑量維持，可以獲得較好的抗排斥作用。針對早期的急性排斥反應(yīng)，及時處理可以恢復(fù)正常。 2.參照皮膚及心臟移植急性排斥反應(yīng)的分級標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合本實驗大體及病理觀察，建立了舌移植急性排斥反應(yīng)的觀察指標(biāo)和分級標(biāo)準(zhǔn)，可以對急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時間