登革病毒prM基因片段dsRNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)免疫的初步研究.pdf

1、登革熱(DengueFever,DF)是登革病毒(DengueVirus，DENV)感染引起的急性傳染病，是世界上廣泛傳播的蟲媒病毒性疾病之一。其主要傳播媒介是埃及伊蚊(Aedesaegypti)和白紋伊蚊(Aedesalbopictus)。控制媒介伊蚊是防治DF最有效的方法，然而傳統(tǒng)上控制媒介的措施有許多局限導(dǎo)致防治效果下降，如抗藥性增強(qiáng)，環(huán)境污染，成本太高等。以現(xiàn)代分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)為蚊媒疾病的防治提供了一個(gè)新的途徑

2、。轉(zhuǎn)基因蚊蟲研究的最重要的一步是研制出抗性因子。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)作為近年來研究的熱門，已被廣泛地應(yīng)用到各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括基因功能研究，抗病毒治療等。在蚊細(xì)胞內(nèi)引入登革病毒的雙鏈RNA能使蚊細(xì)胞對(duì)登革病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖產(chǎn)生抗性，即細(xì)胞內(nèi)免疫(intracellularimmunization)。構(gòu)建能在蚊蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄登革病毒的雙鏈RNA的重組載體是其中關(guān)鍵的一步。 本研究根據(jù)登革Ⅱ型病毒NGC株

3、prM基因的部分序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物，第1對(duì)與第2對(duì)引物僅上游引物引入的酶切位點(diǎn)不同。以感染登革Ⅱ型病毒的白紋伊蚊C6/36細(xì)胞提取的總RNA為模板，用RT-PCR的方法擴(kuò)增約400bp大小的prM基因片段。將PCR產(chǎn)物用T-A克隆的方法插入到pMD18-T載體，得到pMDa和pMDb重組質(zhì)粒。通過雙酶切鑒定和測(cè)序表明，所克隆的序列為登革Ⅱ型病毒prM基因序列。與登革病毒Ⅱ型NGC株相比，prM基因片段(去掉兩端部分引物的序列)的同源性為9

4、9％，387個(gè)堿基中有兩個(gè)堿基不同，分別是第132位A變?yōu)镚，編碼的氨基酸沒有變，第166位T變?yōu)镃，編碼的氨基酸由F變?yōu)長。將pMDb以KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切得到的小片段插入到pMDa質(zhì)粒上，得到具有prM基因正向序列和反向重復(fù)序列串聯(lián)結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pMD-prm-irprm.再將prm-irprm串聯(lián)結(jié)構(gòu)以HindⅢ和SacⅠ雙酶切，并亞克隆到昆蟲表達(dá)載體pIEx-1上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pIE-prm-irprm.將pMDb以Kp

5、nⅠ和PstⅠ雙酶切得到的小片段插入到pIEx-1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIE-irpm作為對(duì)照質(zhì)粒之一。雙酶切鑒定和測(cè)序表明載體構(gòu)建成功。在轉(zhuǎn)染之前，所有轉(zhuǎn)染用的質(zhì)粒用QIAGEN的EndoFreePlasmidMaxiKit質(zhì)粒抽提試劑盒抽提。將重組質(zhì)粒和各對(duì)照質(zhì)粒用脂質(zhì)體Cellfectin轉(zhuǎn)染白紋伊蚊C6/36細(xì)胞，再用登革Ⅱ型病毒和Ⅰ型病毒感染細(xì)胞，觀察免疫效果。通過對(duì)照組質(zhì)粒pIE-irprm的RT-PCR檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染成功，且pI

6、E-irprm能在C6/36細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。通過TCID50測(cè)定病毒的滴度，描繪滴度隨時(shí)間的變化曲線，表明轉(zhuǎn)染pIE-prm-irprm的細(xì)胞感染的登革病毒的滴度比對(duì)照組plE-irprm，pIEx-1和空細(xì)胞的低。 這些研究表明：以RT-PCR擴(kuò)增目的片段，利用T載體及其限制酶切位點(diǎn)亞克隆構(gòu)建轉(zhuǎn)錄登革病毒發(fā)夾狀dsRNA的方法簡單可行；IE1啟動(dòng)子及其上游的hr5增強(qiáng)子結(jié)構(gòu)在C6/36細(xì)胞內(nèi)有活性；轉(zhuǎn)染pIE-prm-irprm的