吲哚胺2,3-雙加氧酶在非霍奇金淋巴瘤免疫耐受中的作用及機制探討.pdf

1、研究背景：
　　 非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一組起源于淋巴結(jié)或其他淋巴組織的常見惡性腫瘤，病因及發(fā)病機制至今仍不甚清，免疫耐受可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。以利妥昔單抗(抗CD20單抗)為代表的針對淋巴瘤的免疫靶向治療已取得良好療效。但仍存在一個重要問題就是無法克服腫瘤細胞形成的免疫耐受，機體免疫系統(tǒng)無法對腫瘤細胞進行有效的識別和殺傷。免疫耐受形成過程中涉及到的主要細胞包括：樹突狀細胞(dendritic cells，

2、DCs)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatoryT cells，Tregs)、肥大細胞、甚至是暏酸性粒細胞，腫瘤細胞亦可直接或間接通過樹突狀細胞等誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)部免疫耐受微環(huán)境。因此，研究NHL腫瘤細胞如何直接或間接通過抗原呈遞細胞形成免疫耐受的腫瘤微環(huán)境，從而針對性地阻斷腫瘤免疫耐受形成的關(guān)鍵通路，將對NHL治療起到關(guān)鍵性的輔助作用。
　　 作為近年來的研究熱點，色氨酸代謝在誘導(dǎo)免疫耐受形成中的作用不斷見諸報道。吲哚胺2，3-雙加氧酶

3、(Indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)是色氨酸代謝中肝臟以外唯一可催化色氨酸分子中吲哚環(huán)氧化裂解，從而沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶；主要表達于一些免疫耐受或免疫特赦組織中，如胸腺、胃腸道粘膜、附睪、胎盤及眼前房等，并且特異性地表達在巨噬細胞和樹突狀細胞上。通過對小鼠和人DCs的大量研究發(fā)現(xiàn)，高表達IDO的DCs亞群與機體的免疫耐受密切相關(guān)，如參與誘導(dǎo)T細胞凋亡、T細胞失能及活化調(diào)節(jié)性T細胞。研究表明，IDO在腫

4、瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中高表達，從而被證實參與了腫瘤的免疫耐受機制，并在其中發(fā)揮重要作用。以1-甲基色氨酸(1-MT)為代表的IDO抑制劑已在國外用于Ⅰ期臨床試驗，并取得了良好的療效。
　　 研究者發(fā)現(xiàn)，凡是IDO高表達的部位，如胎盤、腫瘤及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，都存在大量調(diào)節(jié)性T細胞浸潤的現(xiàn)象。調(diào)節(jié)性T細胞于1995年首次報道，其中轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是Tregs的特異性標(biāo)志，是發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。Tregs同樣在維持自身免疫耐受中起重要作

5、用，其作用已在多種自身免疫、腫瘤模型中得到證實，而且最新研究顯示Tregs的增殖及活化可能與IDO+DC亞群密切相關(guān)。已有研究證實：在多種腫瘤、腫瘤細胞系、急性白血病及成人T細胞白血病/淋巴瘤中存在著IDO的過表達，并通過對小鼠淋巴瘤模型的研究證實了IDO的過表達與Tregs增殖存在相關(guān)性。然而IDO上調(diào)Tregs的具體機制尚待進一步的研究。
　　 本課題旨在研究IDO在NHL患者組織水平上的表達情況，探討其與Tregs的相關(guān)性

6、及其在NHL發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中的作用。進而通過體外實驗和建立NHL動物模型，驗證IDO在NHL腫瘤誘導(dǎo)的免疫耐受中的作用，并對其作用機制進行細致的研究和探討。為臨床發(fā)掘新的判斷NHL預(yù)后的指標(biāo)，并為IDO抑制劑1-MT的臨床應(yīng)用提供有力的理論支持。
　　 第Ⅰ部分 IDO和FoxP3在人非霍奇金淋巴瘤中的表達及意義
　　 研究目的：
　　 以人NHL標(biāo)本為研究對象，探討IDO在NHL中的表達情況，分析其與臨床特征

7、以及與Tregs的相關(guān)性
　　 研究方法：
　　 1.收集NHL空白石蠟切片(n=57)，以反應(yīng)性增生(n=18)為對照，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)研究IDO和FoxP3在組織中的表達及部位。
　　 2.收集NHI_，新鮮標(biāo)本(n=20)，以實時定量RT-PCR技術(shù)比較IDO和FoxP3在mRNA水平的表達情況。
　　 3.收集NHL新鮮標(biāo)本(n=20)，利用western blot技術(shù)比較IDO和FoxP3在

8、蛋白水平的表達情況。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析IDO在NHL和反應(yīng)性增生中的表達差異及其與FoxP3的相關(guān)性。探討IDO與非霍奇金淋巴瘤臨床病例資料如年齡、性別、臨床分期、病理類型、LDH及預(yù)后等因素之間的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果顯示，對照組IDO陽性細胞率均在30％以下，而57例NHL石蠟切片中，IDO+NHL(陽性細胞率在30％以上者)為18例(31.58％)。18例IDO+NHL石蠟切片

9、的FoxP3陽性率顯著高于對照組及39例IDONHL切片。IDO-NHL切片的FoxP3陽性率與對照組無顯著差異。結(jié)合NHL患者臨床病例資料，18例IDO+NHL患者的臨床分期多為Ⅲ或Ⅳ期，而39例IDO-NHL患者臨床分期相對較早，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IDO+NHL患者LDH值以及腫瘤直徑同樣顯著大于IDO-NHL患者。以上數(shù)據(jù)均提示IDO與NHL預(yù)后密切相關(guān)。
　　 2.20例新鮮NHL標(biāo)本經(jīng)實時定量RT-PCR測定，ID

10、OmRNA表達量顯著高于對照組(2-dCt：0.00582～0.546 v.0～0.0103，P<0.05)。對于NHL組內(nèi)進行IDO與FoxP3mRNA表達的相關(guān)性分析，兩者呈正相關(guān)(r=0.447)。
　　 3.20例新鮮NHL標(biāo)本經(jīng)WB測定，IDO蛋白表達量顯著高于對照組(0.77±0.25 vs.0.18±0.18，P<0.05)。NHL組內(nèi)，IDO與FoxP3在蛋白水平上的表達呈正相關(guān)(r=0.613)。
　　

11、 結(jié)論：
　　 1.部分NHL組織內(nèi)存在IDOmRNA和蛋白高表達。
　　 2.IDO的高表達與NHL臨床分期、LDH值等密切相關(guān)，提示IDO可能指示了NHL患者預(yù)后不良。
　　 3.IDO的表達與FoxP3呈正相關(guān)，推測IDO+NHL腫瘤細胞可能與Tregs存在功能上的密切聯(lián)系。
　　 第Ⅱ部分高表達IDO的淋巴瘤細胞株對Tregs調(diào)控作用的研究
　　 研究目的：
　　 以高表達IDO的

12、小鼠B系淋巴瘤細胞株A20及小鼠T細胞為研究對象，體外混合細胞培養(yǎng)，證實高表達IDO的淋巴瘤細胞株可上調(diào)Tregs的比例。
　　 研究方法：
　　 1.免疫磁珠技術(shù)(MACS)分離BALB/c小鼠CD4+CD25-T細胞，并通過流式細胞術(shù)驗證其純度。
　　 2.選取高表達IDO的A20細胞系(源于BALB/c小鼠)，將IDO+A20細胞系與BALB/c小鼠CD4+CD25-T細胞分為以下三組共同培養(yǎng)：①CD4+C

13、D25-T細胞組；②CD4+CD25-T細胞+A20細胞組；③CD4+CD25-T細胞+A20細胞+1-甲基色氨酸組。
　　 3.培養(yǎng)24小時后，流式細胞術(shù)測定CD4+CD25+T細胞的比例。觀察IDO+腫瘤細胞以及IDO抑制劑1-MT對Tregs增殖和功能的影響。
　　 4.MACS技術(shù)收集第②組中培養(yǎng)后的CD4+CD25+T細胞：MACS技術(shù)分離BALB/c小鼠脾臟中的DCs；Ficoll分離BALB/c小鼠脾臟中的

14、單個核細胞(MNC)。分為以下4組進行混合淋巴細胞反應(yīng)：①CD4+CD25+Tc+DCs+MNC；②MNC+DCs；③MNC組；④CD4+CD25+Tc組。培養(yǎng)72h后，MTT法測定其在570nm吸光度值(A值)，計算CD4+CD25+T細胞的抑制率(supressive rate，SR)。SR=[1-(A1-A3-A4)/(A2-A3)]×100％
　　 研究結(jié)果：
　　 1.流式細胞術(shù)驗證MACS技術(shù)分離得到的CD4

15、+CD25-T細胞純度在98％以上。
　　 2.混合細胞培養(yǎng)24小時后，流式細胞術(shù)測定CD4+CD25+T細胞比例：第①組為0；第②組為7.87±1.65％；第③組為3.32±1.19％，證實高表達IDO的A20細胞系可誘導(dǎo)CD4+CD25T細胞向CD4+CD25+表型轉(zhuǎn)化，而且1-MT可明顯抑制該過程。
　　 3.MTT法分析測定轉(zhuǎn)化后CD4+CD25+T細胞的抑制功能：陽性對照組A值明顯高于陰性對照組(0.8657±

16、0.0353 vs0.3434±0.0319，P<0.05)，說明T細胞在DCs的作用下增殖、活化；而實驗組A值明顯小于陽性對照組(0.4331±0.0280vs0.8657±0.0353，P<0.05)，證實轉(zhuǎn)化后的Tregs具有抑制T細胞增殖的作用(抑制率為82.54±7.31％)。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20細胞系在體外可穩(wěn)定高表達IDO。
　　 2.免疫磁珠技術(shù)是一種簡單有效的細胞分離手段，可被廣泛應(yīng)

17、用于臨床和基礎(chǔ)研究中。
　　 3.IDO+腫瘤細胞可在體外將CD4+CD25+T細胞向CD4+CD25+T細胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的CD4+CD25-T細胞具有免疫抑制功能。
　　 4.IDO抑制劑1-MT可逆轉(zhuǎn)體外IDO+腫瘤細胞將CD4+CD25-T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細胞的過程，說明這一轉(zhuǎn)化具有IDO依賴性。
　　 第Ⅲ部分動物模型的建立及IDO對Tregs調(diào)控作用的探討
　　 研究目的：

18、　　 通過NHL動物模型，研究IDO+NHL小鼠Tregs在腫瘤、引流淋巴結(jié)及脾臟中的含量以及使用IDO抑制劑1-MT對Tregs的影響
　　 研究方法：
　　 1.建立NHL動物模型：選6-8周齡左右BALB/c小鼠，皮下注射A20細胞懸液(5×106/只)。
　　 2.1周后選取腫瘤大小相近的小鼠入組實驗，以同周齡的正常BALB/c小鼠為對照，分為以下三組：正常對照組(n=6)，腫瘤組(n=6)，1-MT干

19、預(yù)組(n=6)。
　　 3.對于1-MT干預(yù)組，每R瘤內(nèi)注射1-MT溶液，正常組和腫瘤組注射同體積PBS。
　　 3.2周后處死小鼠，收集腫瘤、脾臟、淋巴結(jié)，通過流式細胞術(shù)檢測各組Tregs在腫瘤組織、淋巴結(jié)及脾臟中的含量；通過Western Blot檢測IDO和FoxP3在組織中的表達。收集數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較各組差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.A20 B細胞淋巴瘤模型成瘤率為95％，成瘤時間為

20、7天左右。
　　 2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果
　　 就CD+CD25+T細胞在腫瘤組織、脾臟、淋巴結(jié)中占淋巴細胞的比例而言，腫瘤組均明顯高于1-MT干預(yù)組，也明顯高于正常對照組。
　　 CD4+T細胞在腫瘤組織、脾臟內(nèi)占淋巴細胞的比例，腫瘤組、1-MT組和對照組之間無差異。在腫瘤引流淋巴結(jié)和對照淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+T細胞占淋巴細胞的比例腫瘤組明顯低于正常對照組，但與1-MT干預(yù)組之間無明顯差異，1-MT干預(yù)組同樣明顯低

21、于正常對照組。
　　 腫瘤組織內(nèi)，CD4+CD25+T細胞/CD4+T細胞腫瘤組明顯高于1-MT干預(yù)組。脾臟內(nèi)，CD4+CD25+T細胞/CD4+T細胞在腫瘤組中的比例為明顯高于正常組，也明顯高于1-MT組。正常對照組和1-MT組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腫瘤引流淋巴結(jié)和對照淋巴結(jié)內(nèi)，CD4+CD25+T細胞/CD4+T細胞在腫瘤組中的比例明顯高于正常組(P<0.001)，也明顯高于1-MT組。1-MT組仍高于正常對照組。
　

22、　 3.Western Blot
　　 結(jié)果顯示，IDO在腫瘤組和1-MT組腫瘤、脾臟、淋巴結(jié)中表達均明顯高于對照組。
　　 FoxP3在腫瘤組腫瘤、脾臟和淋巴結(jié)中的表達明顯高于正常對照組，也明顯高于1-MT組。1-MT組與正常對照組之間無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.A20 B細胞淋巴瘤是一種良好的NHL動物模型。
　　 2.IDO在動物模型的腫瘤、脾臟、腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)高表達，通過上調(diào)