吲哚胺2,3-雙加氧酶抑制小鼠心臟移植排斥反應(yīng)作用機(jī)制的研究.pdf

1、本課題旨在研究吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)在小鼠異位心臟移植排斥反應(yīng)中的抑制作用及其機(jī)制，采用轉(zhuǎn)染IDO基因的供體小鼠樹突細(xì)胞(IDO+DC)與色氨酸代謝產(chǎn)物(TC)聯(lián)合對受體進(jìn)行干預(yù)，以期使增殖T細(xì)胞在DC傳遞抗原期間處于色氨酸饑餓且TC大量累積的狀態(tài)中，造成T細(xì)胞增殖抑制或克隆刪除，檢驗在此狀態(tài)下抑制移植排斥反應(yīng)的強度，為成功誘導(dǎo)免疫耐受提供實驗基礎(chǔ)。
　　 第一部分IDO+DC和TC聯(lián)合應(yīng)用對T細(xì)胞的抑制作用
　

2、　 目的:研究IDO+DC和TC對體外培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的抑制作用。
　　 方法:通過攜帶IDO基因的腺病毒轉(zhuǎn)染供體DC而獲得IDO+DC。在體外實驗中，獲取受體脾CD4+T淋巴細(xì)胞，分別與供體DC、DC+TC、IDO+DC和IDO+DC+TC進(jìn)行混合培養(yǎng)。在體內(nèi)實驗中，分別向受體注射供體DC、TC、IDO+DC及IDO+DC+TC，5天后獲取受體脾CD4+T淋巴細(xì)胞，分別與供體DC進(jìn)行混合培養(yǎng)。IDO+DC+TC注射組獲取的受體

3、脾CD4+T淋巴細(xì)胞再分別與供體DC和第三系DC進(jìn)行混合培養(yǎng)。各組均檢測T細(xì)胞凋亡率及增殖刺激指數(shù)(SI)。
　　 結(jié)果:在體外實驗中，與IDO+DC+TC混合培養(yǎng)的受體T細(xì)胞SI明顯降低，而T細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。在體內(nèi)實驗中，注射IDO+DC+TC的受體T細(xì)胞SI亦明顯降低，而T細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。供體DC刺激的IDO+DC+TC注射組T細(xì)胞SI較第三系DC的SI低，而其T細(xì)胞凋亡率明顯升高，差

4、異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:聯(lián)合應(yīng)用IDO+DC及TC較單獨給予這兩種干預(yù)因素對T淋巴細(xì)胞具有更強的抑制作用，并有可能誘導(dǎo)針對供體的抗原特異性免疫抑制。
　　 第二部分小鼠同種異位心臟移植模型的建立
　　 目的:建立穩(wěn)定、可靠的小鼠同種異位心臟移植模型，為體內(nèi)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。
　　 方法:通過顯微外科技術(shù)分兩階段建立該動物模型，第一階段為模型制作訓(xùn)練階段，第二階段為穩(wěn)定階段

5、，并對麻醉方式、供心處理等方面進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)。
　　 結(jié)果:穩(wěn)定階段進(jìn)行手術(shù)80例，手術(shù)成功率(91.25％)較訓(xùn)練階段(29％)明顯提高(P＜0.01)，且兩階段中無一動物死于麻醉意外。模型穩(wěn)定階段中，血管吻合失敗率、移植心缺血時間及手術(shù)時間等較訓(xùn)練階段均明顯縮短(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:長期進(jìn)行顯微外科技術(shù)訓(xùn)練對避免實驗動物的浪費和保障后續(xù)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要的意義。成功的麻醉是手術(shù)成功的前提，提高血管吻合質(zhì)

6、量是手術(shù)成功的關(guān)鍵，此模型穩(wěn)定可靠，是研究器官移植排斥反應(yīng)的理想動物模型。
　　 第三部分IDO+DC和TC聯(lián)合應(yīng)用對小鼠異位心臟移植排斥反應(yīng)的抑制作用及其機(jī)制研究
　　 目的:研究聯(lián)合應(yīng)用供體IDO+DC和TC對移植排斥反應(yīng)的抑制作用，探討IDO抗排斥反應(yīng)的作用機(jī)制。
　　 方法:術(shù)前給予受體不同干預(yù)，包括注射PBS、未轉(zhuǎn)染DC、空病毒轉(zhuǎn)染DC、CsA(10mg/kg/d)、TC、IDO+DC、IDO+DC+T

7、C等。觀察移植物存活時間。術(shù)后7天獲取移植物行組織病理學(xué)檢查、qRT-PCR檢測細(xì)胞因子和IDO mRNA的表達(dá)水平、Western Blot及免疫組化染色檢測IDO蛋白的表達(dá)水平。獲取受體外周血行流式細(xì)胞學(xué)檢測T細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:與PBS組、未轉(zhuǎn)染DC組、空病毒轉(zhuǎn)染DC組比較，TC和IDO+DC組的供心生存期明顯延長(P＜0.01)，病理分級程度下降(P＜0.05)，IDOmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高（P＜0.01）

8、，TNF-αmRNA的表達(dá)量降低(P＜0.05)，而IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)水平增高(P＜0.05)，且T細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)。與TC和IDO+DC組比較，IDO+DC+TC組供心生存期延長(P＜0.05)，IDOmRNA和蛋白表達(dá)水平增高(P＜0.05)，IL-2、IFN-γ、TNF-αmRNA的表達(dá)量均降低（除與IDO+DC組相比IL-2mRNA下降無統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05），IL-10mRNA和蛋白表達(dá)水均增

9、高(P＜0.05)，T細(xì)胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)，而病理分級程度雖有所降低但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:術(shù)前注射轉(zhuǎn)染IDO基因的供體DC及TC對小鼠心臟移植排斥反應(yīng)的抑制作用較單獨應(yīng)用這兩種干預(yù)因素更強，表明IDO通過色氨酸耗竭和色氨酸代謝產(chǎn)物累積兩條途徑同時發(fā)揮抗排斥作用。
　　 第四部分IDO+DC和TC聯(lián)合應(yīng)用抑制排斥反應(yīng)的抗原特異性研究
　　 目的:觀察聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染IDO基因的供體

10、DC和TC對小鼠心臟移植后皮膚移植排斥反應(yīng)的抑制作用。
　　 方法:按第三部分方法建立IDO+DC+TC實驗組，對其中供心存活超過30天的受體分別進(jìn)行供體來源和第三系來源的皮膚移植，觀察移植皮片的存活情況及病理學(xué)表現(xiàn)。
　　 結(jié)果:供體來源的移植皮片在術(shù)后兩周仍存活，僅出現(xiàn)輕度的皮膚卷邊和毛發(fā)脫落，皮下組織少量炎性細(xì)胞浸潤。而第三系來源的移植皮片在術(shù)后十天已完全結(jié)痂、脫落，皮下組織大量炎性細(xì)胞浸潤。
　　 結(jié)論: