高植物蛋白飼料導(dǎo)致的花鱸攝食抑制分子調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、花鱸（Lateolabrax japonicus）是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖肉食性魚類品種，對(duì)配合飼料中魚粉依賴性較高，在花鱸飼料中用植物蛋白替代魚粉會(huì)導(dǎo)致花鱸出現(xiàn)明顯的攝食抑制現(xiàn)象。本文主要對(duì)由高植物蛋白飼料引起的花鱸攝食抑制的分子機(jī)制及其攝食調(diào)控機(jī)理進(jìn)行初步研究，包括三部分內(nèi)容，摘要分別如下:
　　1.花鱸Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)因子全長(zhǎng)cDNA的克隆和序列分析
　　

2、本試驗(yàn)采用簡(jiǎn)并引物反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增（3'RACE和5'RACE）技術(shù)克隆花鱸（Lateolabrax japonicus）攝食調(diào)控因子雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）、核糖體蛋白S6激酶beta-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1）、神經(jīng)肽Y前體（neuropeptide Y precurs

3、or）、腦腸肽前體(preproghrelin)和刺鼠相關(guān)蛋白（agouti-related protein，AgRP）基因cDNA全長(zhǎng)序列。結(jié)果顯示:花鱸mTOR基因（GenBank登錄號(hào)KJ746670）cDNA全長(zhǎng)8296 bp，開放閱讀7551 bp，編碼2516個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為286.14 Ku，與其他物種的相似性為62.0％～98.0％; S6K1基因（GenBank登錄號(hào)KJ746671）cDNA全長(zhǎng)2232 b

4、p，開放閱讀框1539bp，編碼512個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為56.87 Ku，與其他物種的相似性為80.4％～84.9％;NPY precursor基因(GenBank登錄號(hào)KJ850326) cDNA全長(zhǎng)676 bp，開放閱讀框300 bp，編碼99個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為11.26 Ku，與其他物種的相似性為53.6％～99.0％;preproghrelin基因（GenBank登錄號(hào)KJ850327）cDNA全長(zhǎng)1201 bp

5、，開放閱讀框324bp，編碼107個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為12.03 Ku，與其他物種的相似性為19.6％～85.0％;AgRP1基因（GenBank登錄號(hào)KJ825853）cDNA全長(zhǎng)739 bp，開放閱讀框429 bp，編碼142個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為15.86 Ku，與其他物種的相似性為28.9％～88.0％; AgRP2基因（GenBank登錄號(hào)KJ825854）cDNA全長(zhǎng)1357 bp，開放閱讀框351 bp，編碼11

6、6個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子質(zhì)量為13.46 Ku，與其他物種的相似性為22.4％～93.1％，花鱸攝食調(diào)控因子cDNA全長(zhǎng)序列的獲得將為進(jìn)一步研究其攝食調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　2.高植物蛋白導(dǎo)致的花鱸攝食抑制時(shí)期Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調(diào)控信號(hào)通路的響應(yīng)
　　試驗(yàn)設(shè)置等氮等能的對(duì)照組（全魚粉組）和高植物蛋白組（混合植物蛋白完全替代魚粉）飼料投喂花鱸。在高植物蛋白組出現(xiàn)明顯攝食抑制現(xiàn)象時(shí)

7、，分別對(duì)對(duì)照組和高植物蛋白組花鱸攝食后3、6、9、12及24h的下丘腦、肝臟和胃組織Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)基因進(jìn)行RT-qPCR分析，試驗(yàn)結(jié)果表明:花鱸攝食后各時(shí)間點(diǎn)，胃組織中，攝食后3、6、9及12h魚粉組mTOR的基因表達(dá)均顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);胃中魚粉組攝食后6和24h、肝臟中魚粉組攝食餐后9和12h S6K1的基因表達(dá)均顯著低于植物蛋白組(P＜0.05)

8、，而胃中魚粉組攝食后12h S6K1的基因表達(dá)則顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);肝臟中魚粉組攝食后6和9h leptin基因表達(dá)量顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);下丘腦中植物蛋白組和魚粉組NPY precursor的基因表達(dá)在餐后各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異(P＞0.05);胃中魚粉組攝食后6hpreproghrelin基因表達(dá)顯著低于植物蛋白組(P＜0.05);下丘腦中植物蛋白組和魚粉組AgRP1的基因表達(dá)在餐后各時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差

9、異(P＞0.05)，攝食后6h魚粉組AgRP2的表達(dá)顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);mTOR和leptin的表達(dá)降低和preproghrelin表達(dá)的增加說明了高植物蛋白組花鱸因拒絕攝食而導(dǎo)致機(jī)體能量水平降低，而高植物蛋白導(dǎo)致的攝食抑制時(shí)期花鱸中樞攝食調(diào)控系統(tǒng)對(duì)饑餓狀態(tài)缺乏有效的響應(yīng)可能是導(dǎo)致其拒食植物蛋白飼料的原因。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究肉食性魚類對(duì)高植物蛋白飼料攝食抑制分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。
　　3.高植物蛋白導(dǎo)致花鱸攝食

10、抑制時(shí)期下丘腦和胃差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組分析
　　本試驗(yàn)研究了高植物蛋白飼料對(duì)肉食性魚類花鱸攝食抑制的分子機(jī)制，在實(shí)驗(yàn)第三周出現(xiàn)明顯攝食抑制現(xiàn)象時(shí)提取投喂后花鱸的RNA樣品，通過RNA-Seq技術(shù)，檢測(cè)對(duì)照組（魚粉為唯一蛋白源）和實(shí)驗(yàn)組（全植物蛋白組）攝食后下丘腦和胃組織的基因表達(dá)水平變化。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明:胃組織中共有5個(gè)與攝食調(diào)控相關(guān)的差異表達(dá)基因，下丘腦中共有10個(gè)與攝食調(diào)控相關(guān)的差異基因;其中促胃泌素釋放肽、胰高血糖素樣肽2受體、雌