高植物蛋白飼料導致的花鱸攝食抑制分子調控機制的初步研究.pdf

1、花鱸（Lateolabrax japonicus）是我國重要的海水養(yǎng)殖肉食性魚類品種，對配合飼料中魚粉依賴性較高，在花鱸飼料中用植物蛋白替代魚粉會導致花鱸出現(xiàn)明顯的攝食抑制現(xiàn)象。本文主要對由高植物蛋白飼料引起的花鱸攝食抑制的分子機制及其攝食調控機理進行初步研究，包括三部分內容，摘要分別如下:
　　1.花鱸Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調控信號通路相關因子全長cDNA的克隆和序列分析
　　

2、本試驗采用簡并引物反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和cDNA末端快速擴增（3'RACE和5'RACE）技術克隆花鱸（Lateolabrax japonicus）攝食調控因子雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）、核糖體蛋白S6激酶beta-1（ribosomal protein S6 kinase beta-1，S6K1）、神經肽Y前體（neuropeptide Y precurs

3、or）、腦腸肽前體(preproghrelin)和刺鼠相關蛋白（agouti-related protein，AgRP）基因cDNA全長序列。結果顯示:花鱸mTOR基因（GenBank登錄號KJ746670）cDNA全長8296 bp，開放閱讀7551 bp，編碼2516個氨基酸，預測其分子質量為286.14 Ku，與其他物種的相似性為62.0％～98.0％; S6K1基因（GenBank登錄號KJ746671）cDNA全長2232 b

4、p，開放閱讀框1539bp，編碼512個氨基酸，預測其分子質量為56.87 Ku，與其他物種的相似性為80.4％～84.9％;NPY precursor基因(GenBank登錄號KJ850326) cDNA全長676 bp，開放閱讀框300 bp，編碼99個氨基酸，預測其分子質量為11.26 Ku，與其他物種的相似性為53.6％～99.0％;preproghrelin基因（GenBank登錄號KJ850327）cDNA全長1201 bp

5、，開放閱讀框324bp，編碼107個氨基酸，預測其分子質量為12.03 Ku，與其他物種的相似性為19.6％～85.0％;AgRP1基因（GenBank登錄號KJ825853）cDNA全長739 bp，開放閱讀框429 bp，編碼142個氨基酸，預測其分子質量為15.86 Ku，與其他物種的相似性為28.9％～88.0％; AgRP2基因（GenBank登錄號KJ825854）cDNA全長1357 bp，開放閱讀框351 bp，編碼11

6、6個氨基酸，預測其分子質量為13.46 Ku，與其他物種的相似性為22.4％～93.1％，花鱸攝食調控因子cDNA全長序列的獲得將為進一步研究其攝食調控機理奠定基礎。
　　2.高植物蛋白導致的花鱸攝食抑制時期Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調控信號通路的響應
　　試驗設置等氮等能的對照組（全魚粉組）和高植物蛋白組（混合植物蛋白完全替代魚粉）飼料投喂花鱸。在高植物蛋白組出現(xiàn)明顯攝食抑制現(xiàn)象時

7、，分別對對照組和高植物蛋白組花鱸攝食后3、6、9、12及24h的下丘腦、肝臟和胃組織Ghrelin/Leptin-NPY/AGRP和mTOR-NPY攝食調控信號通路相關基因進行RT-qPCR分析，試驗結果表明:花鱸攝食后各時間點，胃組織中，攝食后3、6、9及12h魚粉組mTOR的基因表達均顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);胃中魚粉組攝食后6和24h、肝臟中魚粉組攝食餐后9和12h S6K1的基因表達均顯著低于植物蛋白組(P＜0.05)

8、，而胃中魚粉組攝食后12h S6K1的基因表達則顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);肝臟中魚粉組攝食后6和9h leptin基因表達量顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);下丘腦中植物蛋白組和魚粉組NPY precursor的基因表達在餐后各時間點均無顯著性差異(P＞0.05);胃中魚粉組攝食后6hpreproghrelin基因表達顯著低于植物蛋白組(P＜0.05);下丘腦中植物蛋白組和魚粉組AgRP1的基因表達在餐后各時間點均無顯著性差

9、異(P＞0.05)，攝食后6h魚粉組AgRP2的表達顯著高于植物蛋白組(P＜0.05);mTOR和leptin的表達降低和preproghrelin表達的增加說明了高植物蛋白組花鱸因拒絕攝食而導致機體能量水平降低，而高植物蛋白導致的攝食抑制時期花鱸中樞攝食調控系統(tǒng)對饑餓狀態(tài)缺乏有效的響應可能是導致其拒食植物蛋白飼料的原因。以上結果為進一步研究肉食性魚類對高植物蛋白飼料攝食抑制分子機制提供了理論依據。
　　3.高植物蛋白導致花鱸攝食

10、抑制時期下丘腦和胃差異表達轉錄組分析
　　本試驗研究了高植物蛋白飼料對肉食性魚類花鱸攝食抑制的分子機制，在實驗第三周出現(xiàn)明顯攝食抑制現(xiàn)象時提取投喂后花鱸的RNA樣品，通過RNA-Seq技術，檢測對照組（魚粉為唯一蛋白源）和實驗組（全植物蛋白組）攝食后下丘腦和胃組織的基因表達水平變化。轉錄組結果表明:胃組織中共有5個與攝食調控相關的差異表達基因，下丘腦中共有10個與攝食調控相關的差異基因;其中促胃泌素釋放肽、胰高血糖素樣肽2受體、雌