2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、裂頭蚴?。╯parganosis)主要是由曼氏迭宮絳蟲(Spirometra mansoni)幼蟲-裂頭蚴(sparganum)感染而引起的一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,該病呈世界性分布。裂頭蚴感染人體后,可在各種組織器官內(nèi)移行引起炎癥反應(yīng),導(dǎo)致皮下包塊、失明、肢體麻痹、癲癇、甚至死亡。傳統(tǒng)的迭宮屬絳蟲的鑒別主要是通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定,而迭宮屬絳蟲的幼蟲階段缺乏形態(tài)學(xué)特征難以鑒別,因此,應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)迭宮屬絳蟲幼蟲進(jìn)行蟲種鑒定及遺傳變異分

2、析,對(duì)裂頭蚴病的防治具有重要意義。此外,裂頭蚴含有重復(fù)序列的抗原多肽(antigenic polypeptide,SAP,GenBank No.AB019222.1)可能是裂頭蚴的保護(hù)性抗原,對(duì)裂頭蚴的免疫逃避及其在宿主體內(nèi)的長(zhǎng)期寄生可能起著重要作用。
  為了鑒定裂頭蚴河南不同地理株的蟲種、研究其遺傳變異與系統(tǒng)發(fā)育地位,本文從河南省6個(gè)地區(qū)(開封、鄭州、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河、周口)自然感染的青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴,經(jīng)口感染家貓后收集蟲卵

3、與成蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,選取曼氏迭宮絳蟲3個(gè)線粒體基因(cox1、cox3和nad4)作為分子標(biāo)記,對(duì)河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴進(jìn)行了序列分析及遺傳變異分析。此外,本文還應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)裂頭蚴抗原多肽基因進(jìn)行了克隆與表達(dá),將純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠獲得重組蛋白免疫血清,應(yīng)用Westernblotting及間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)發(fā)現(xiàn)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期的表達(dá)及其在蟲體組織的定位,并將其用于裂頭蚴感染小鼠血清的特

4、異性抗體的檢測(cè),對(duì)裂頭蚴病的檢測(cè)提供新的候選抗原。
  材料與方法:
  1.裂頭蚴的采集與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染:從河南省漯河、開封、鄭州、新鄉(xiāng)、通許、扶溝六地區(qū)自然感染青蛙體內(nèi)分離裂頭蚴。將六地區(qū)分離出的裂頭蚴經(jīng)口感染6只3月齡的無(wú)病原體家貓(10條/只),在感染后8~25天當(dāng)中,每天使用自然沉淀法收集貓糞便中的蟲卵在顯微鏡下進(jìn)行鑒定,感染后4周將貓剖殺,從貓小腸內(nèi)收集成蟲并進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。
  2.幼蟲和成蟲目的基因的擴(kuò)增

5、及序列分析:對(duì)曼氏迭宮絳蟲cox1、cox3和nad4三個(gè)線粒體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將純化后的PCR產(chǎn)物送北京金唯智生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。首先使用Clustal X v2.0中的默認(rèn)參數(shù)設(shè)置對(duì)3個(gè)基因序列進(jìn)行比對(duì)然后在Se-Alv2.0a11中對(duì)比對(duì)序列進(jìn)行校正。使用MEGA v5.0軟件進(jìn)行遺傳距離分析。
  3.系統(tǒng)發(fā)育分析:最后分別利用PAUP*4b10、PhyML v3.0和MrBayes v3.1軟件對(duì)cox1+cox3

6、+pnad4三基因聯(lián)合序列進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法(MP)、最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)分析,并繪制曼氏迭宮絳蟲河南省6個(gè)地區(qū)分離株的系統(tǒng)發(fā)育樹。
  4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá):合成裂頭蚴抗原多肽基因,并在序列兩端添加酶切位點(diǎn)5' BamHⅠ和3'HindⅢ,保證在裂頭蚴抗原多肽基因序列中僅有BamHⅠ和HindⅢ2個(gè)酶切位點(diǎn)。將多肽基因克隆至載體pUC57-Kan。將目的基因雙酶切后亞克隆至表達(dá)載體pMAL-c2X,構(gòu)建

7、重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21,對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定,結(jié)果正確后用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體沉淀經(jīng)超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE,觀察是否有抗原多肽蛋白的表達(dá),并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性分析。
  5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:應(yīng)用Amylose樹脂預(yù)裝柱對(duì)表達(dá)的裂頭蚴抗原多肽重組蛋白進(jìn)行親和層析純化,將純化后的

8、重組蛋白免疫BALB/c小鼠,獲得重組蛋白免疫血清,通過(guò)Western blotting應(yīng)用重組蛋白免疫血清對(duì)重組蛋白、裂頭蚴可溶性抗原及ES抗原進(jìn)行識(shí)別。
  將從自然感染蛙體與實(shí)驗(yàn)感染鼠體內(nèi)分離的裂頭蚴以及貓?bào)w內(nèi)收集的成蟲進(jìn)行石臘切片,應(yīng)用IFA檢測(cè)裂頭蚴抗原多肽在曼氏迭宮絳蟲不同發(fā)育期蟲體的表達(dá)及其在蟲體組織的定位。應(yīng)用重組蛋白與裂頭蚴ES蛋白分別用于檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠及其他寄生蟲感染小鼠血清,觀察SAP-ELISA診斷裂頭

9、蚴病的敏感性與特異性。
  結(jié)果:
  1.蟲卵與成蟲的形態(tài)學(xué)鑒定:裂頭蚴經(jīng)口感染貓后11天,在貓糞便中發(fā)現(xiàn)蟲卵;感染后4周從每只貓的小腸內(nèi)檢出10條26~45厘米長(zhǎng)的成蟲。蟲卵卵殼較薄、淺灰褐色、呈橢圓形,52~76微米長(zhǎng)、31~44微米寬,且兩端稍尖、一端有卵蓋,內(nèi)有一個(gè)卵細(xì)胞和若干個(gè)卵黃細(xì)胞?;谌缦滦螒B(tài)特征將收集的成蟲鑒定為曼氏迭宮絳蟲:頭節(jié)背、腹面各有一條縱行的吸槽,成節(jié)和孕節(jié)結(jié)構(gòu)基本相似,肉眼可見每個(gè)節(jié)片中部凸起

10、的子宮。并且在節(jié)片中部依次有雄性生殖孔、雌性生殖孔和子宮孔三個(gè)開口。
  2.裂頭蚴河南不同地理株的遺傳變異分析:鄭州、開封、通許、扶溝、新鄉(xiāng)、漯河6地區(qū)收集的裂頭蚴及其成蟲的cox1,cox3和nad4基因片段,均被成功擴(kuò)增,其序列長(zhǎng)度分別為417、390和578bp,且成蟲與幼蟲序列大小完全一致。cox1,cox3和nad4基因片段均富含AT堿基(AT含量分別為63.5%,68.3%和67%),其序列變化范圍分別為0-4.4%

11、、0-0.8%和0-0.5%。
  3.裂頭蚴河南不同地理株的系統(tǒng)發(fā)育分析:cox1,cox3和nad4序列的最適進(jìn)化模型分別為TN93+I、HKY+G和HKY+I。對(duì)cox1+cox3+pnad4聯(lián)合序列分別采用最大簡(jiǎn)約法、最大似然法和貝葉斯法的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴分離株與其他迭宮屬(Spirometra)絳蟲一起形成一個(gè)具有高支持值的單系分支(其自展值和后驗(yàn)概率值分別為100、99和1.0),并與裂頭屬(

12、Diphyllobothrium)絳蟲分支互為姊妹類群。
  4.裂頭蚴抗原多肽基因的克隆與表達(dá):對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行酶切鑒定,電泳后出現(xiàn)2條帶,1條帶為線性的pMAL-c2X(大小為6646 bp);另1條為783bp,與裂頭蚴抗原多肽的理論值大小相同,表明重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP構(gòu)建成功。對(duì)重組質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)在68.7 kDa處出現(xiàn)一條明顯的

13、蛋白帶(載體融合蛋白40 kDa+目的蛋白28.7 kDa),表明重組蛋白表達(dá)成功,可溶性分析發(fā)現(xiàn)重組蛋白以可溶形式表達(dá)。
  5.裂頭蚴抗原多肽重組蛋白的鑒定:Western blotting結(jié)果顯示,裂頭蚴抗原多肽重組蛋白可被裂頭蚴感染小鼠血清所識(shí)別;重組蛋白免疫血清可識(shí)別裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原,在28.7kDa處有1條蛋白帶,表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在。IFA結(jié)果顯示,重組蛋白免疫血清與蛙體與鼠

14、體內(nèi)的裂頭蚴均呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng),蟲體皮層及內(nèi)部組織均呈黃綠色熒光,但與成蟲則為陰性反應(yīng),蟲體呈橘紅色,表明裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá),在成蟲期則不表達(dá)。SAP-ELISA和ES-ELISA檢測(cè)裂頭蚴感染小鼠血清抗體陽(yáng)性率分別為83.8%(25/30)和100%(30/30),SAP-ELISA的陽(yáng)性率低于ES-ELISA(P<0.05)。檢測(cè)弓形蟲、血吸蟲、旋毛蟲感染小鼠血清和正常小鼠血清均為陰性。
  結(jié)論:
  1.經(jīng)形態(tài)

15、學(xué)及分子生物學(xué)鑒定,河南6個(gè)地區(qū)的裂頭蚴分離株均屬于曼氏迭宮絳蟲,cox1,cox3和nad4基因均能很好地揭示裂頭蚴各地理株線粒體之間的遺傳變異,且cox1的變異程度最高,cox3次之而nad4的變異程度最低。
  2.成功構(gòu)建了裂頭蚴抗原多肽的表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-SAP,重組蛋白以可溶形式表達(dá)。Western blotting與IFA結(jié)果表明,裂頭蚴抗原多肽在裂頭蚴期表達(dá),在裂頭蚴可溶性抗原和ES抗原均存在,定位于蟲體皮

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