解偶聯(lián)蛋白2通過線粒體介導(dǎo)參與高血糖加重腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病高血糖加重腦缺血再灌注損傷，促進(jìn)缺血后線粒體相關(guān)的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生。解偶聯(lián)蛋2(Uncoupling protein2,UCP2)是線粒體內(nèi)膜蛋白，它容許 H+穿越線粒體內(nèi)膜而降低線粒體 H+梯度，從而穩(wěn)定線粒體內(nèi)膜電位和減少ROS的產(chǎn)生。但目前UCP2在高血糖加重腦缺血損傷中的作用以及其調(diào)節(jié)途徑尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)研究擬采用敲除 UCP2基因小鼠(KO-UCP2)模擬糖尿病

2、高血糖和腦缺血再灌注損傷狀態(tài)，探討敲除UCP2基因是否增加神經(jīng)元損傷及其可能的分子通路。
　　方法：將雄性敲除 UCP2基因小鼠(KO-UCP2)及野生型 C57BL/6j小鼠分為野生型小鼠正常血糖腦缺血再灌注組（CN組）、KO-UCP2小鼠正常血糖腦缺血再灌注組(KN組)、KO-UCP2小鼠正常糖尿病高血糖腦缺血再灌注組(KH組)。采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備Ⅰ型糖尿病小鼠模型，通過大腦中動(dòng)脈缺血(

3、middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立局灶性腦缺血再灌注模型。通過病理組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫熒光、TTC染色、原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)標(biāo)記法(TUNEL)、RT-PCR、Western blot方法，對(duì)比觀察各組神經(jīng)元形態(tài)變化、細(xì)胞凋亡及Cyt C、Cleaved Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)再灌注24h，KN組神經(jīng)

4、功能評(píng)分高于CN組，KH組神經(jīng)功能評(píng)分明顯高于KN組（P＜0.05）。(2)TTC染色結(jié)果，再灌注24h，KN組梗死面積大于CN組，KH組梗死面積明顯大于KN組（P＜0.05）。(3)組織學(xué)結(jié)果，缺血中心區(qū)，正常血糖CN、KN組再灌注6h部分神經(jīng)元核固縮、腫脹，間質(zhì)水腫；再灌注24h，神經(jīng)元變性壞死加重，部分神經(jīng)細(xì)胞消失，結(jié)構(gòu)破壞，形態(tài)不規(guī)則；再灌注72h，缺血中心區(qū)壞死的神經(jīng)細(xì)胞脫落，出現(xiàn)炎性細(xì)胞和大量膠質(zhì)細(xì)胞。在相同再灌注時(shí)間高血糖

5、組損傷更為明顯。缺血周圍區(qū)，正常血糖CN、KN組再灌注6h，出現(xiàn)腦水腫表現(xiàn)；再灌注24h，缺血周圍區(qū)界限清晰可辨，部分神經(jīng)元變性壞死，間質(zhì)疏松呈網(wǎng)格狀改變，水腫明顯；再灌注72h水腫明顯改善，可見大量膠質(zhì)細(xì)胞浸潤。與正常血糖組相比，KH組水腫和細(xì)胞損傷情況更為嚴(yán)重。(4)TUNEL染色結(jié)果,再灌注24h TUNEL陽性表達(dá)明顯增加，KN組凋亡指數(shù)高于CN組，KH組明顯高于KN組（P＜0.05）；再灌注72hTUNEL陽性表達(dá)下降，KH組

6、凋亡指數(shù)明顯高于KN組（P＜0.05）。(5) Cyt C、Caspase-3免疫組化結(jié)果。再灌注6h開始出現(xiàn)Cyt C、Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)；再灌注24h達(dá)到高峰，KN組陽性表達(dá)高于CN組，KH組明顯高于KN組（P＜0.05）；再灌注72h陽性表達(dá)下降，KN組高于CN組，KH組Caspase-3陽表達(dá)高于KN組（P＜0.05）。(6)Cleaved Caspase-9免疫熒光染色及雙標(biāo)結(jié)果。再灌注6h陽性細(xì)胞開始表達(dá)，24h

7、達(dá)到高峰隨后下降。再灌注6、24、72h，KN組陽性細(xì)胞數(shù)及免疫熒光雙標(biāo)數(shù)高于CN組，KH組明顯高于KN組（P＜0.05）。(7)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。再灌注6h CytC、Caspase-9、Caspase-3mRNA表達(dá)開始升高，KH組表達(dá)量明顯高于KN組；再灌注24h達(dá)高峰，KN組表達(dá)量明顯高于CN組，KH組明顯高于KN組（P＜0.05）；再灌注72h下降KN組CytC、Caspase-9mRNA表達(dá)量明顯高于CN組，KH組Cas

8、pase-3mRNA表達(dá)量明顯高于KN組（P＜0.05）。(8)Western Blot結(jié)果再灌注6h時(shí)Cyt C出現(xiàn)表達(dá)，KN組明顯高于CN組（P＜0.05）；再灌注24h表達(dá)升高達(dá)到高峰，KN組Cyt C表達(dá)明顯高于CN組，KH組明顯高于KN組；72h時(shí)下降，KH組表達(dá)明顯高于KN組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：（1）糖尿病高血糖加重局灶性腦缺血再灌注損傷，導(dǎo)致缺血面積增大、神經(jīng)功能損傷增加、缺血周圍腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡增加。（2