精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)創(chuàng)面愈合影響的研究.pdf

1、目的：通過(guò)制作大鼠背部創(chuàng)傷模型，在大鼠模型的飲食中加入適量的L-精氨酸(L-arginine L-Arg)，并在傷口局部聯(lián)合應(yīng)用纖維連接蛋白(Fibronectin FN)，干預(yù)創(chuàng)面的愈合過(guò)程，觀察L-精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)創(chuàng)面愈合速度和愈合質(zhì)量的影響；并通過(guò)免疫組織化方法揭示創(chuàng)傷過(guò)程中一氧化氮合酶的表達(dá)規(guī)律；通過(guò)光鏡觀察愈合期間不同階段的成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原纖維含量；通過(guò)組織化學(xué)方法檢測(cè)肉芽組織中羥脯氨酸含量；通過(guò)實(shí)驗(yàn)前后的對(duì)

2、比，計(jì)算創(chuàng)面的愈合率。研究L-精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)促進(jìn)傷口愈合的影響，為臨床探索一條促進(jìn)創(chuàng)面愈合的有效方法，并為進(jìn)一步深化創(chuàng)面愈合修復(fù)的臨床研究提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康Wistar大鼠48只，稱重，編號(hào)。 2、實(shí)驗(yàn)分組：將大鼠隨機(jī)分為4組：即對(duì)照組(0.9％生理鹽水)、實(shí)驗(yàn)A組(L-精氨酸500mg/kg/d聯(lián)合0.5mg/ml的FNO.05ml．)、實(shí)驗(yàn)B組(0.5mg/

3、ml的FNO.05ml)、實(shí)驗(yàn)C組(L-精氨酸500mg/kg/d)。每組12只。 3、創(chuàng)面模型制備方法：大鼠背部剪毛，10％硫化鈉脫毛，溫水清洗，拭干。次日，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉(30 mg/kg)成功后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上。在背部脊柱兩側(cè)旁開(kāi)1cm，頭尾兩端平行于脊柱各標(biāo)記一個(gè)直徑1.8 cm，面積2.54 cm<'2>的圓形切口線。經(jīng)碘伏消毒皮膚后，用剪刀沿標(biāo)記線剪除全層皮膚至深筋膜，形成4個(gè)圓形創(chuàng)面。取0.5m

4、g/ml纖維連接蛋白溶液注射于實(shí)驗(yàn)A組及B組創(chuàng)面筋膜層及創(chuàng)緣皮下組織內(nèi)，每個(gè)創(chuàng)面0.05 ml，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均給予0.9％生理鹽水敷料包扎。待大鼠清醒后，按照500mg/kg/d計(jì)算分別給予實(shí)驗(yàn)A組及C組L-精氨酸灌胃。每日換藥一次(動(dòng)物處死當(dāng)天不換藥)。實(shí)驗(yàn)A組及B組每天每個(gè)創(chuàng)面注射0.05 ml/d的FN，直至處死動(dòng)物。 4、取材：每組動(dòng)物分為4組，每幺且3只，分別在術(shù)后3、7、10、14天切取原創(chuàng)傷范圍內(nèi)組織，隨機(jī)將一塊

5、組織固定在4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋切片，分別行常規(guī)HE染色、VG染色及免疫組化染色。剩余的組織于-20℃冷凍保存，行組織化學(xué)檢測(cè)。 5、觀察指標(biāo)： (1)大體觀察。 (2)成纖維細(xì)胞密度(numerical density on area，NA)：400倍光鏡下觀察HE染色切片，在肉芽組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10個(gè)矩形視野(0.0052mm<'2>/視野)，目測(cè)計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均

6、數(shù)。(3)膠原纖維面密度(area density on area，AA)：VG染色組織切片，在肉芽組織中央淺部、中央深、兩側(cè)部各隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算紅染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。 (4)按照羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定肉芽組織羥脯氨酸含量。 (5)對(duì)免疫組化染色切片，光鏡觀察NOS2分布部位和著色深淺程度。采用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率。 (6)術(shù)后觀察創(chuàng)面愈合情況，并按公式計(jì)算創(chuàng)

7、面愈合率愈合率=(原始創(chuàng)面面積一未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以X±S表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)照組于創(chuàng)傷后14天可以完全愈合：實(shí)驗(yàn)A組肉芽組織生長(zhǎng)良好，且愈合時(shí)間較對(duì)照組提前3-4天，實(shí)驗(yàn)B組、C組愈合情況良好，較對(duì)照組提前1-2天。 2、光鏡觀察：實(shí)

8、驗(yàn)A組在創(chuàng)傷后3天比對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)B、C組均有較多的的毛細(xì)血管生成，創(chuàng)傷后14天成纖維細(xì)胞排列整齊；實(shí)驗(yàn)B、C組于創(chuàng)傷后3天也有較多的毛細(xì)血管生成，但較實(shí)驗(yàn)A組少，且炎性反應(yīng)亦較實(shí)驗(yàn)A組嚴(yán)重。 3、成纖維細(xì)胞密度(NA)：實(shí)驗(yàn)A、B、C組在創(chuàng)傷后3、7天NA均高于對(duì)照組水平(P<0.05)，而在創(chuàng)傷后10、14天均低于對(duì)照組(P<0.05)：而實(shí)驗(yàn)A組較B、C組更為明顯P<0.01)。 4、膠原纖維面密度(AA)：四組均

9、呈持續(xù)性增加的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)A組在所有時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組(P<0.01)：B組、C組在所有時(shí)間點(diǎn)亦高于對(duì)照組(P<0.05)。 5、羥脯氨酸含量：對(duì)照組羥脯氨酸含量從創(chuàng)傷后第3天到第14天進(jìn)行性增加：實(shí)驗(yàn)A組在創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)羥脯氨酸含量均高于對(duì)照組(P<0.01)；實(shí)驗(yàn)B組和C組在各時(shí)間點(diǎn)的的羥脯氨酸含量亦高于對(duì)照組(P<0.05)。 6、NOS2陽(yáng)性細(xì)胞比率：對(duì)照組傷后3天細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度增強(qiáng)并達(dá)到高峰，3-7天細(xì)胞中的N

10、OS2在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)維持穩(wěn)定水平，傷后10天細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)再次達(dá)到一個(gè)高峰，其后陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱。而實(shí)驗(yàn)A、B、C三組創(chuàng)傷后3天開(kāi)始細(xì)胞陽(yáng)性染色增強(qiáng)，到第10天時(shí)達(dá)到高峰，其中以A組陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)(A組P<0.01，B、C組P<0.05)，其后陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱。 7、創(chuàng)面愈合率：實(shí)驗(yàn)A、B、C三組于3天后創(chuàng)面愈合較對(duì)照組明顯加快，其中A組較B、C組顯著加快(A組P<0.01，B、C組P<0.05)。 結(jié)論：在創(chuàng)面