丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療口腔粘膜下纖維化的臨床療效和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、研究背景：口腔粘膜下纖維化(oral submucous fiborsis，OSF)是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的炎性疾病，主要病理變化包括上皮組織萎縮、粘膜固有層和粘膜下層膠原纖維堆積變性、血管閉塞減少。臨床上患者表現(xiàn)為口腔粘膜逐漸變蒼白、緊縮失去彈性、觸摸有條索感、張口受限和吞咽困難等癥狀。WHO將OSF列為癌前狀態(tài)，湖南省OSF癌變率高達(dá)1.7％。咀嚼檳榔是OSF主要的致病因素，其發(fā)病機(jī)制至今不明，可能與免疫、遺傳、代謝障礙等

2、有關(guān)。復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制導(dǎo)致該病至今尚無滿意的治療方法。以往曾用的手術(shù)治療常因手術(shù)次數(shù)多、創(chuàng)傷大、術(shù)后瘢痕攣縮而不易被患者接受；雷公藤多甙、糖皮質(zhì)激素等藥物治療常由于容易引起胃腸道刺激、骨質(zhì)疏松和皮質(zhì)功能減退等副作用而不能長期服用?；谝陨显?，尋找有效、安全的OSF治療方法成為目前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 根據(jù)OSF的病理特征，從降低病變組織的免疫炎性反應(yīng)、改善微循環(huán)障礙等方面著手尋找治療OSF的有效方法成為可能?；谔瞧べ|(zhì)激素因

3、其良好的抗炎作用而仍是多種組織纖維化疾病的首選藥物，同時丹參具有良好的活血化瘀功能且丹參水提物和丹參素能防治潑尼松所致的骨質(zhì)疏松，本研究采用中西藥結(jié)合治療，觀察丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍局部注射治療OSF的臨床療效，評價兩者聯(lián)合應(yīng)用在降低病變組織的免疫炎性反應(yīng)、改善其微循環(huán)障礙從而抗纖維化的作用，同時通過高通量、高效率的差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從整體水平研究丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF的潛在機(jī)制并加以驗(yàn)證。
　　 研究目的：建立完善的

4、OSF臨床和病理資料管理系統(tǒng)；觀察并比較丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍及單獨(dú)使用潑尼松龍治療OSF的臨床療效；尋找丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF的相關(guān)蛋白；驗(yàn)證丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF的相關(guān)蛋白。
　　 研究方法(1)建立OSF組織標(biāo)本庫，運(yùn)用Access2003、Excel2003等軟件建立OSF臨床資料數(shù)據(jù)庫，對患者進(jìn)行追蹤觀察。
　　 (2)選取OSF初診患者中、晚期各60例，各隨機(jī)分為兩組，分別采用丹參聯(lián)合小劑

5、量潑尼松龍及單獨(dú)使用潑尼松龍治療3個月，比較用藥前、后患者病損面積、張口度和疼痛指數(shù)的變化，比較兩治療方案的臨床療效。
　　 (3)利用固相pH梯度雙向凝膠電泳技術(shù)分離OSF組和丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療組頰粘膜組織的總蛋白，建立雙向凝膠電泳圖譜，應(yīng)甩PDQuest凝膠分析軟件分析識別兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，應(yīng)用MALDI-TOF-MS對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。
　　 (4)采用Western blot免疫印跡方法對鑒

6、定出的差異蛋白之一——14-3-3σ蛋白進(jìn)行蛋白水平的驗(yàn)證；選取OSF患者頰粘膜組織48例，其中早期15例、中期18例、晚期15例，丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF后的頰粘膜組織15例，正常頰粘膜組織10例，運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測14-3-3σ蛋白在各組織中的分布和表達(dá)。
　　 研究結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了OSF組織標(biāo)本庫，自行設(shè)計開發(fā)了OSF臨床資料數(shù)據(jù)庫，收集了300余例患者的臨床資料，為后續(xù)研究提供了條件。
　　 (2

7、)丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF3個月后，第1組口腔粘膜下纖維化中期和晚期患者的灰白色病損面積分別由10.37±3.40 cm2、19.60±3.27 cm2減少為5.90±4.10 cm2、16.33±4.02 cm2，中晚各期治療前后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：張口度分別由3.41±0.77 cm、1.98±0.39 cm增加為3.87±0.67 cm、2.26±0.46 cm，中晚各期治療前后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

8、P<0.05)。第2組治療后中期患者的灰白色病損面積由10.8±3.18 cm2減少為6.70±3.75 cm2，張口度分別由3.57±0.75cm增加為3.97±0.69 cm，治療前后比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而晚期治療前后比較，其灰白色病損面積和張口度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組方法治療口腔粘膜下纖維化中期的有效率分別為86.66％、73.33％，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；而兩組方法治療口腔

9、粘膜下纖維化晚期的有效率分別為70％、16.67％，兩組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。丹參與潑尼松龍聯(lián)合用藥治療口腔粘膜下纖維化，還可減少潑尼松龍引起的不良反應(yīng)。
　　 (3)獲得了背景清晰、重復(fù)性好、高質(zhì)量的雙向凝膠電泳圖譜，篩選出與丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF相關(guān)的23個蛋白質(zhì)分子，其中在丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF后的頰粘膜組織中高表達(dá)的有4個，分別為14-3-3σ、K4、Serotransferrin、Hem

10、oglobin subunit beta；在丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF后的頰粘膜組織中低表達(dá)的有19個，分別為K6、α-SMA、肌球蛋白(5個亞型)、原肌球蛋白(3個亞型)、ANXA2、S100A7、GAPDH和HspB5等，這些蛋白可能與丹參和潑尼松龍的作用機(jī)制密切相關(guān)。
　　 (4)14-3-3σ蛋白在正常頰粘膜組織和丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍治療OSF后的頰粘膜組織中的表達(dá)高于在OSF頰組織中的表達(dá)(P<0.05)，與差

11、異蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。
　　 研究結(jié)論：(1)OSF組織標(biāo)本庫和臨床資料數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)可作為OSF基礎(chǔ)及臨床研究很好的技術(shù)平臺。
　　 (2)丹參聯(lián)合小劑量潑尼松龍局部注射治療OSF中期、晚期具有良好療效，可作為安全有效治療OSF的方法進(jìn)行推廣。
　　 (3)14-3—3σ、K4、Serotransferrin、Hemoglobin subunit beta、K6、α-SMA、肌球蛋白、原肌球蛋白、ANXA2、S