版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
1、阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,以進(jìn)行性多項(xiàng)認(rèn)知損害為主要表現(xiàn)的綜合征?;颊吣X中三大病理特征為淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)元丟失。近年來細(xì)胞內(nèi)Aβ、線粒體功能紊亂在AD發(fā)病中的作用已成為研究熱點(diǎn)。
淀粉樣蛋白結(jié)合醇脫氫酶(ABAD)位于線粒體基質(zhì),催化醛、酮、醇及類固醇等的氧化或還原。Aβ存在時(shí),Aβ可與ABAD結(jié)合,使后者構(gòu)象改變,引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激可致細(xì)胞死亡。而無Aβ環(huán)境下,ABAD在應(yīng)激情
2、況下對(duì)機(jī)體有保護(hù)作用。
為更好研究ABAD與Aβ結(jié)合后在AD發(fā)病中的作用及ABAD本身的生理作用,建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基礎(chǔ)。目前已成功新建立神經(jīng)元內(nèi)選擇性ABAD基因敲除小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該小鼠一般性狀、特征,及線粒體功能,且對(duì)于引起人類MHBDD疾病的ABAD三個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行了初步的研究,為ABAD在線粒體內(nèi)的功能提供一些線索。
第一部分選擇性ABAD基因敲除對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞及其線粒體功能影響
3、的初步研究
目的:選擇性神經(jīng)元內(nèi)ABAD基因敲除小鼠(ABAD ko小鼠)是新建立的小鼠模型,需要明確其基本特征及神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能。探索神經(jīng)元內(nèi)ABAD表達(dá)量下降導(dǎo)致線粒體功能紊亂的可能原因。
方法:使用CREB PCR及FLOX MR鑒定ABAD ko小鼠基因型。使用westernblot及免疫熒光染色鑒定ABAD在其大腦皮層及海馬表達(dá)量。TMRM熒光染色了解線粒體膜電位變化,MitoSOX熒光染色觀察線
4、粒體氧自由基的釋放,用ATP試劑盒測(cè)定腦組織ATP含量,TUNEL試劑盒染色觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。免疫熒光染色及Western blot觀察MHB、CypD及其它多種蛋白表達(dá)量的改變。用ImageJ對(duì)Western blot條帶及熒光染色進(jìn)行量化,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算ATP腦組織含量,對(duì)TUNEL陽性的細(xì)胞及神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)等,用student t test比較基因敲除小鼠與對(duì)照小鼠的差異。
結(jié)果:ABAD ko小鼠基因型為CR
5、EB(+)且FLOXΔAneo。Western Blot結(jié)果提示ABAD ko小鼠皮層及海馬ABAD的表達(dá)量明顯下降,密度值分別為皮層0.81±0.129 vs.0.29±0.031,P=0.00098,海馬1.74±0.144 vs.1.00±0.160,P=0.01894。免疫熒光染色提示ABAD ko小鼠上述部位ABAD表達(dá)量下降。MHB染色發(fā)現(xiàn)ABAD ko小鼠皮層MHB較wt小鼠明顯增多,密度值為11.14±0.609 vs。
6、6.92±0.354,P=0.018,海馬中ABAD ko小鼠MHB密度值較wt小鼠高,但P=0.48,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中TMRM染色明顯減低(1.00±0.081 vs。0.75±0.049,P=0.036),運(yùn)動(dòng)感覺皮層無明顯降低(P=0.754)。MitoSOX染色在ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層中明顯升高(1.00±0.062 vs.1.37±0.085,P=0.004),而在運(yùn)動(dòng)感覺皮層無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0
7、.336)。腦組織ATP含量測(cè)定ABAD ko小鼠數(shù)值相對(duì)低,但兩組小鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能取腦時(shí)間及部位不同影響結(jié)果(wt小鼠腦ATP含量2.54±0.282,ABAD ko小鼠ATP含量2.11±0.210,P=0.264)。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)7-8月ABAD ko小鼠皮層及海馬均有TUNEL陽性細(xì)胞,較對(duì)照組明顯升高,且內(nèi)嗅皮層區(qū)神經(jīng)元與總神經(jīng)細(xì)胞比值明顯下降,提示有神經(jīng)元丟失(ABAD ko小鼠內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元與總細(xì)胞比值0.298
8、±0.069,wt小鼠0.67±0.050,P=0.032),而3-5個(gè)月的ABAD ko及wt小鼠大腦皮層或海馬中均無TUNEL陽性染色,且皮層運(yùn)動(dòng)感覺區(qū)及內(nèi)嗅皮層均無明顯神經(jīng)元丟失。另外Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)CypD、nrf2、SODII、GFAP在ABAD ko小鼠腦組織中明顯升高,COXIV、PSD95、Synaptophysin等表達(dá)量明顯下降。
結(jié)論:ABAD ko小鼠的基因型為CREB(+)且FLOX
9、△neo,皮層及海馬神經(jīng)元中ABAD表達(dá)量明顯降低,其底物MHB在上述部位堆積,為導(dǎo)致下游膜電位下降,ROS增多及細(xì)胞凋亡的原因之一。ABAD ko小鼠腦中CypD表達(dá)量升高,可能為導(dǎo)致線粒體功能紊亂的另一原因。ABAD ko小鼠大腦皮層中內(nèi)嗅皮層損傷嚴(yán)重。GFAP,SoDII,Nrf2表達(dá)量上升,可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞增生對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激有關(guān),PSD95、Synaptophysin表達(dá)量降低,提示突觸功能受影響。
第二部分
10、 ABAD及三種突變體對(duì)氧化應(yīng)激損害反應(yīng)的研究
目的:人類疾病MHBDD是由ABAD基因某些位點(diǎn)的點(diǎn)突變引起。既往認(rèn)為是突變?cè)斐葾BAD對(duì)MHB酶活性下降導(dǎo)致MHB在腦內(nèi)堆積引起發(fā)病,而最近有報(bào)道認(rèn)為還有其它途徑損傷線粒體。因此,本研究建立空載體轉(zhuǎn)染、wtABAD轉(zhuǎn)染及三個(gè)mutABAD轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定細(xì)胞系,觀察wtABAD及三種突變體對(duì)氧化應(yīng)激損害的反應(yīng),研究ABAD突變引起線粒體功能紊亂的可能途徑。
方法:建
11、立穩(wěn)定表達(dá)的空載體,wtABAD,三個(gè)mutABAD(R130C,D86G,Q165H)的SK-N-SH細(xì)胞系。用Western blot檢驗(yàn)ABAD表達(dá)量,AEC染色鑒定細(xì)胞形態(tài)及純度。選出合適的克隆后,加入H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,用MTT試劑盒、ATP試劑盒,測(cè)定各個(gè)細(xì)胞系中細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及細(xì)胞內(nèi)ATP含量的變化。兩組間MTT數(shù)值及ATP含量差異用student t test檢驗(yàn)。
結(jié)果:wtABAD組與空載體轉(zhuǎn)染的對(duì)
12、照相比,H2O2處理24小時(shí)濃度為25uM,50uM,100uM組及處理48小時(shí)濃度為25uM,50uM組,MTT值明顯升高(P<0.05)。wtABAD轉(zhuǎn)染的ABAD表達(dá)量不同的克隆里,對(duì)氧化應(yīng)激均具有明顯保護(hù)作用,且ABAD表達(dá)量低,保護(hù)作用相對(duì)好,H2O2濃度高時(shí)保護(hù)作用更明顯。mutABAD組里,100uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后MTT發(fā)現(xiàn),R130C及Q165G組MTT值與對(duì)照相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(R130C:0.80±0
13、.033 vs.0.73±0.059,P=0.340;Q165H:0.80±0.033 vs.0.89±0.050,P=0.162),D86G組數(shù)值明顯下降(0.80±0.033 vs。0.48±0.011,P=0.011)。250uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后MTT發(fā)現(xiàn),D86G、R130C數(shù)值明顯下降(D86G:0.50±0.076 vs.0.08±0.002,P=0.001;R130C:0.50±0.076 vs.0.15±0.
14、021,P=0.001),Q165H數(shù)值上升(0.50±0.076 vs.0.69±0.019,P=0.030)。
ATP結(jié)果提示H2O2100uM,200uM處理24小時(shí)后,對(duì)照組ATP含量較wtABAD組明顯降低(100uM:0.90±0.086 vs.1.18±0.079,P=0.036:200uM:0.66±0.071 vs.1.07±0.092,P=0.006)。50uM H2O2處理,wtABAD至48小時(shí)AT
15、P含量無明顯下降,而對(duì)照組ATP含量明顯下降(24hr:1.01±0.066 vs.0.95±0.081,P=0.391;48hr:0.83±0.032 vs.1.05±0.071,P=0.036)。而三個(gè)mutABAO組,100uM及200uM H2O2處理細(xì)胞24小時(shí)后測(cè)定ATP發(fā)現(xiàn),ATP值與對(duì)照相比均無明顯升高。
結(jié)論:H2O2引起的氧化應(yīng)激情況下,wtABAD轉(zhuǎn)染SK細(xì)胞克隆對(duì)細(xì)胞均有保護(hù)作用,而三種mutABA
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫(kù)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 58078.杜仲橡膠顆粒結(jié)合蛋白的理化特性分析及肉桂醇脫氫酶基因克隆
- 乙醛脫氫酶基因克隆及酶功能研究.pdf
- Gluconobacter thailandicus D-阿拉伯糖醇脫氫酶和木糖醇脫氫酶基因的克隆及協(xié)同表達(dá).pdf
- 馬肝醇脫氫酶基因的克隆表達(dá)及活性研究.pdf
- 慢性缺氧-再氧合對(duì)小鼠腦Nip3、細(xì)胞凋亡及β-淀粉樣蛋白沉積的影響.pdf
- 干預(yù)β-淀粉樣前體蛋白裂解酶基因減少神經(jīng)細(xì)胞β淀粉樣蛋白的產(chǎn)生.pdf
- 蠟梅肉桂醇脫氫酶基因CpCAD的克隆、表達(dá)特性分析及功能驗(yàn)證.pdf
- 基因定點(diǎn)突變提高人醇脫氫酶ADH2蛋白酶活性的研究.pdf
- 水稻線粒體乙醛脫氫酶在轉(zhuǎn)基因煙草中的研究.pdf
- 基因沉默11β-羥類固醇脫氫酶1型對(duì)胰島β細(xì)胞NIT-1的功能影響.pdf
- 孝順竹木質(zhì)素肉桂醇脫氫酶的功能研究.pdf
- 線粒體乙醛脫氫酶基因多態(tài)E487K對(duì)硝酸甘油療效和代謝的影響.pdf
- 甘露醇發(fā)酵及甘露醇脫氫酶的克隆表達(dá).pdf
- 鈍鱗紫背苔中肉桂醇脫氫酶的基因克隆和功能鑒定.pdf
- 油菜甘油-3-磷酸脫氫酶基因的克隆及功能研究.pdf
- 小鼠乳酸脫氫酶ldh酶聯(lián)免疫分析
- 小鼠乳酸脫氫酶ldh酶聯(lián)免疫分析
- 氧化葡萄糖酸桿菌木糖醇脫氫酶和D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因的克隆與協(xié)同表達(dá).pdf
- 紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷癥
- 高濕環(huán)境對(duì)大鼠肝臟異檸檬酸脫氫酶及α-酮戊二酸脫氫酶的影響
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論