膽管癌67kDa層粘素受體調(diào)控Fas配體表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:Fas配體(FasL)是一種分子量約4萬道爾頓的跨膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子超家族,當(dāng)其與受體Fas結(jié)合后能夠啟動細(xì)胞凋亡。目前,大量研究顯示:FasL不但在激活的T淋巴細(xì)胞上表達(dá),而且在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá),在人膽管癌細(xì)胞中,FasL也呈過表達(dá)。我們的研究及其它一些研究均顯示,當(dāng)高表達(dá)FasL的腫瘤細(xì)胞與Fas+的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),可誘導(dǎo)Fas+的T淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些研究結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸與腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL有關(guān)

2、。然而,關(guān)于腫瘤細(xì)胞FasL表達(dá)的信號調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控,目前研究仍不透徹。我們以往的研究顯示在人膽管癌細(xì)胞中67kDa的層粘素受體(67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)過表達(dá)可誘導(dǎo)FasL的表達(dá),但其信號調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制目前不清楚。
　　 67 kDa層粘素受體(67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)廣泛存在于上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周圍神經(jīng)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及大部分腫瘤細(xì)胞

3、表面,結(jié)合位點(diǎn)為LNβ1鏈的YIGSR序列。67-kDa LNR的高表達(dá),可使癌細(xì)胞與基底膜的黏附力增強(qiáng),有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。67-kDa LNR與LN的結(jié)合誘導(dǎo)了一系列跨膜信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的變化,最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),層粘連蛋白的信號通路參與了有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK的)級聯(lián)反應(yīng)。這些結(jié)果提示:67-kDa LNR表達(dá)上調(diào)可能激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,且MAPK/ERK1/2被激活后,可將信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,從而增加與D

4、NA的結(jié)合,促進(jìn)和調(diào)節(jié)有關(guān)的基因表達(dá)。而腫瘤細(xì)胞67-kDa LNR激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá)目前還不清楚。
　　 在T淋巴細(xì)胞中,FasL基因表達(dá)是受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,包括NF-KB,AP-1,c-Myc等。然而,在腫瘤細(xì)胞中,FasL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受哪些轉(zhuǎn)錄因子的影響目前仍不清楚。C-Myc是一種原癌基因,與腫瘤的分化和發(fā)展密切相關(guān),它和異二聚體Max一起形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體,介導(dǎo)了許多腫瘤生長基因的表達(dá)

5、。而且,c-Myc不但可以引起細(xì)胞的增殖,且可以誘導(dǎo)凋亡,而其誘導(dǎo)凋亡的作用與Fas和FasL的表達(dá)有關(guān),Brunner etal.揭示了c-Myc通過直接與FasL啟動子相互作用,誘導(dǎo)活化T細(xì)胞FasL表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中,c-Myc是否可以調(diào)控FasL的表達(dá)目前還知之甚少。
　　 基于以上研究結(jié)果和思路,所以在本實(shí)驗(yàn)中,我們主要應(yīng)用MAPK/ERKkinase(MEK)特異抑制劑PD98059,來觀察腫瘤細(xì)胞67-kDa LN

6、R能否通過MAPK/ERK1/2信號通路,影響轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的活性,從而調(diào)控人膽管癌細(xì)胞FasL的表達(dá),進(jìn)而影響Jurkat T細(xì)胞的凋亡。
　　 來材料與方法:
　　 1.用RT-PCR和Western-bolt檢測PD98059處理組及未處理組人膽管癌細(xì)胞(QBC939)中c-Myc、p-c-Myc和FasL的表達(dá)。
　　 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染c-Myc干擾質(zhì)粒至人膽管癌細(xì)胞,用RT-PCR和West

7、ern-bolt檢測c-Myc和FasL的表達(dá)。
　　 3.構(gòu)建含F(xiàn)asL啟動子及c-Myc結(jié)合位點(diǎn)(-127/-121)的FasL啟動子的突變體的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,分別與pRL-TK表達(dá)質(zhì)粒一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞,檢測熒光素酶相對活性,比較PD98059處理組及PD98059未處理組人膽管癌細(xì)胞FasL啟動子活性的變化情況;比較c-Myc結(jié)合位點(diǎn)突變前后的FasL啟動子活性變化。
　　 4.染色質(zhì)免疫共沉淀(CH

8、IP)技術(shù)分析p-c-Myc與活體人膽管癌細(xì)胞中FasL基因啟動子的結(jié)合情況。
　　 5.建立人膽管癌細(xì)胞與人Jurkat T細(xì)胞Transwell(R)小室旁分泌共培養(yǎng)模型,用TUNEL法檢測膽管癌細(xì)胞PD98059處理組及PD98059未處理組對Jurkat T細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.PD98059處理組人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)磷酸化c-Myc(p-c-Myc)和FasL的表達(dá)均明顯

9、降低,而c-Myc未見明顯變化;c-Myc干擾組膽管癌細(xì)胞c-Myc和FasL的表達(dá)均明顯降低。
　　 2.構(gòu)建包含F(xiàn)asL啟動子的PGL3-FasL-pro熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒并有c-Myc結(jié)合位點(diǎn)突變的PGL3-FasL-proM熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,均經(jīng)酶切及測序鑒定,表明PGL3-FasL-pro和PGL3-FasL-proM熒光素酶報(bào)告載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 3.運(yùn)用熒火蟲酶活性分析技術(shù)證實(shí)PD98059處理組人膽管

10、癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)熒光素酶活性(FasL基因啟動子活性)與對照組相比明顯下降;c-Myc干擾組及突變體組熒光素酶活性(FasL基因啟動子活性)與對照組相比分別下降約80％和70％。
　　 4.用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)了在人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)中,p-c-Myc與FasL基因啟動子存在結(jié)合關(guān)系。
　　 5.人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)與Jurkat T細(xì)胞共培養(yǎng)后,Jurkat T細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯

11、增加;而PD98059處理人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)后,JurkatT細(xì)胞的凋亡指數(shù)明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)中,MAPK-ERK是67kDa層粘素受體(67-kDaLNR)誘導(dǎo)FasL的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞凋亡的主要信號通路之一。
　　 2.人膽管癌細(xì)胞(QBC939細(xì)胞)中,67-kDa LNR誘導(dǎo)增強(qiáng)FasL基因啟動子的活性有賴于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc