普萘洛爾對映體在經不同誘導劑誘導的人肝細胞中的代謝特征.pdf

1、手性(Chirality) 是一種化學結構特征，它引起分子的不對稱性。近年來，藥物手性的臨床意義已引起了人們的注意。人體的手性環(huán)境和特異的對映體相互作用，導致手性藥物對映體藥代動力學和藥效學的立體選擇性(stereo-selectivity) 差異。在藥理手性差異中研究較多的是藥代動力學的手性特征。它是基于藥物吸收、分布、代謝和排泄過程的對映體選擇性。其中代謝性對映體選擇性發(fā)生率最高（約占40％），且臨床意義更大。以往由于沒有認識到手性

2、藥物各對映體的藥動學行為，特別是代謝的手性差異，所以在藥物相互作用研究中常常將消旋體藥物當作單一化合物來處理。由此得出的結論常與臨床療效或不良反應的發(fā)生存在著不一致的現象，甚至會錯誤地指導臨床用藥。 藥物代謝主要在肝臟，依賴于細胞色素P450 ( cytochrome P450, CYP 450) ，它是藥物進入體內進行生物轉化的重要代謝酶, 參與各種內源性和外源性化合物在體內的代謝過程。該酶系具有專一性不強的特點，即同一種酶

3、可以代謝多種藥物，而同一藥物又可被多個肝藥酶所代謝。由于在肝細胞內蘊含有大量不同種類的肝藥酶，每一種藥物進入體內后，都可能由多種酶參與其代謝。因此宏觀的血藥濃度只能檢測出總體結果，不能考察每種酶對藥物的代謝情況。在聯合用藥過程中，特別是其中某一藥物使參與催化代謝的酶活性顯著增強或減弱時，就會引起其他合用藥物的毒副作用出現或未達療效的情況。對于對映體來說，酶還表現出立體選擇性的差異，從而可能使其中占主藥效的一個對映體的代謝速度改變甚至逆轉

4、。因此，了解各種酶參與對映體的代謝的過程，可為臨床用藥提供參考依據。本實驗研究的手性藥物是普萘洛爾（Propranolol， PPL）對映體。普萘洛爾為非選擇性β-腎上腺素受體阻滯劑，口服后藥物達峰時間為1～3 小時，t1/2 為2～5 小時。 主要在肝臟代謝，首過效應60％～70％，生物利用度僅為30％。臨床上使用的普萘洛爾是左旋異構體S（-）- PPL 和右旋異構體R（+）- PPL 等量混合的消旋品。目前已證實S(- )

5、型對映體的β受體阻斷作用要比R (+)型約強100 倍[6]。 普萘洛爾在CYP450酶系中代謝, 各亞族均有不同程度的催化作用，文獻顯示以CYP 2D6和CYP 1A2 作用較強。以往的研究主要是集中在兩個酶對普萘洛爾的代謝，而對其它酶參與其代謝的研究則甚少涉及。本課題選擇CYP 1A1和CYP 3A4進行考察。 其主要的原因是CYP 1A1雖在肝臟中的含量很低，但此酶極容易被誘導、活化，使肝臟含量迅速增加。許多外

6、源性化合物經CYP 1A1代謝后可產生有毒的代謝產物，能誘發(fā)腫瘤的產生與發(fā)展；CYP 3A4是CYP 450酶系中最重要的亞型, 約占成人肝微粒體CYP450總量的30 ％～40 ％。因此，有必要對這兩種具代表性的肝藥酶在普萘洛爾對映體的代謝過程中的參與情況進行研究和探討。 肝細胞是在人類中檢測CYP 450 酶活性誘導或抑制最合適的實驗研究平臺，是最接近臨床的研究系統(tǒng)。普萘洛爾甚少體外藥動學資料，特別是其對映體的藥代動力學參

7、數資料。因此，本實驗設計以體外培養(yǎng)人肝細胞作為代謝反應系統(tǒng)。對普萘洛爾對映體在經誘導的肝細胞中代謝過程進行了研究，其目的是明確肝藥酶CYP 1A1 和CYP3A4 是否參與普萘洛爾對映體的代謝，并探究其酶動力學和藥代動力學的特征，同時為分子生物學基礎研究和臨床合理用藥提供參考和實驗依據。本實驗包括四方面的內容。 一、肝細胞培養(yǎng)以及肝藥酶CYP 1A1、CYP 3A4 活性的測定 目的：采用人肝細胞作為體外代謝系統(tǒng)，測定

8、經不同濃度的誘導劑誘導后酶代謝底物的情況，以此來描述酶活性的變化，并確定誘導劑的最佳誘導濃度。 方法：通過肝細胞的傳代培養(yǎng)，用MTT 法測定細胞存活率；再分別以7-ER 和睪酮為底物，測定CYP 1A1 和CYP 3A4 的活性變化，以確定BNF 誘導CYP1A1 和RIF 誘導CYP3A4 的最佳濃度。 結果：BNF 誘導CYP 1A1 的最佳藥物濃度為0.8μmol·L-1，而RIF 誘導CYP 3A4 的最佳藥

9、物濃度為15μmol·L-1。 二、普萘洛爾對映體的手性拆分 目的：采用光學純對映體分別加入細胞中進行代謝，但對映體在代謝過程中可能發(fā)生轉化，需要將經過代謝后的對映體進行拆分來驗證。 方法：選用GITC 作為柱前衍生化試劑，進行對映體的柱前衍生化，并通過反相高效液相色譜法檢測。 結果：在本實驗的衍生條件下，消旋體可被完全衍生；普萘洛爾對映體在肝細胞系統(tǒng)代謝過程中沒有發(fā)生結構轉化，可以直接向肝細胞中分別

10、加入R(+)-PPL 和S(-)-PPL進行代謝，檢測液無需再進行拆分前處理。 三、HPLC 中檢測細胞液中普萘洛爾對映體的濃度 目的：建立一種用于體外細胞實驗檢測藥物濃度的高效、簡便、快速、專屬性強的分析方法。 方法： 1. 反相高效液相色譜-熒光檢測法定量檢測普萘洛爾對映體的濃度。 2. 通過指定標準曲線，測定萃取回收率、方法回收率和精密度，對HPLC 方法學進行確證。 結果：

11、 1. S(-)-PPL 和R(+)-PPL 在測定范圍內(0.5～20μmol·L-1)線性關系良好，它們的回歸方程分別為Y = 0.5627X + 0.0581 和Y = 0.6699X - 0.2068，相關系數(r)分別為0.9993 和0.9994。最低定量濃度（LOD，S/N≥9）均為0.5μmol·L-1。 2. S(-)-PPL 和R(+)-PPL 萃取回收率均大于80％，方法回收率均大于90％。日內差

12、均小于8.8％，日間差均小于13.1％。 3. 本方法快捷、準確、專一性強，可用于細胞液樣品中的藥物研究。 四、普萘洛爾對映體的代謝特征 目的：通過處理酶動力學參數，考察CYP 1A1 和CYP 3A4 是否參與普萘洛爾的代謝，并且探究對映體在代謝過程中的立體選擇性；同時處理和歸納藥代動力學參數，為臨床合理用藥提供參考。 方法： 1. 測定在BNF 和INF 的誘導下，以及不經誘導時普萘洛爾酶動

13、力學參數。 2. 分別測定不同時間點時經BNF 和RIF 的誘導以及不經誘導空白對照的普萘洛爾剩余濃度，建立底物濃度-反應時間曲線。 結果： 1．BNF 誘導的CYP1A1 明顯增強了兩對映體催化能力，尤其是對S(-)型對映體的選擇性。CYPP 3A4 在普萘洛爾的代謝中作用較大, 并表現出對R(+)-普萘洛爾作用較強的立體選擇性。 2．R(+)-PPL 比S(-)-PPL 的代謝消除快。經過誘導后

14、，兩對映體的代謝均加快。 結論： 1. 本實驗所選取的兩個酶均參與了普萘洛爾對映體的代謝。 2. 肝藥酶CYP 1A1 對S(-)-PPL 有較強的立體選擇性，而肝藥酶CYP 3A4 則對R(+)-PPL 有顯著的立體選擇性。 3. R(+)-PPL 比S(-)-PPL 的代謝消除快。誘導CYP 3A4 活性的藥物能顯著增加R(+)-PPL的代謝，而誘導CYP 1A1 活性的藥物能顯著增加S(-)-