黃連素在體外和體內(nèi)通過激活A(yù)kt促進(jìn)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活及基質(zhì)合成.pdf

1、目的:軟骨細(xì)胞的凋亡是骨性關(guān)節(jié)炎(OA)的重要特征。本文探討黃連素對OA軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并研究其OA軟骨細(xì)胞保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:1、模擬OA狀態(tài)的大鼠軟骨細(xì)胞部分:(1)大鼠軟骨細(xì)胞從出生24小時內(nèi)SD大鼠的關(guān)節(jié)中分離，并用IL-1β處理2小時模擬OA狀態(tài);(2)MTT方法測定黃連素對大鼠模擬OA細(xì)胞存活率的影響;(3)WesternBlotting分析方法測定黃連素對大鼠模擬OA細(xì)胞總Akt，p-Akt

2、及下游分子(p-p70S6K、p-S6等)，細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)，蛋白多糖(Aggrecan)，Ⅱ型膠原(ColⅡ)的作用。2、人OA軟骨細(xì)胞部分:(1)在罹患OA并行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)病人術(shù)中取關(guān)節(jié)軟骨，分離培養(yǎng)人OA軟骨細(xì)胞;(2)CCK8方法測定黃連素對人OA軟骨細(xì)胞存活率的影響;DAPI染色方法觀察黃連素對人OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響;(3)WesternBlotting分析方法測定黃連素對人OA細(xì)胞p-Akt及下游分子（p-p7

3、0S6K、p-S6等），細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)，蛋白多糖(Aggrecan)，Ⅱ型膠原(ColⅡ)的作用。3、SD大鼠OA模型:(1)采用前交叉韌帶橫斷術(shù)+內(nèi)側(cè)半月板部分切除術(shù)(ACLT+MMx)的方法在SD大鼠中誘導(dǎo)OA模型;(2)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射不同濃度黃連素，術(shù)后10周處死大鼠，并對大體標(biāo)本進(jìn)行觀察比較;(3)對各處理組切片行HE染色及番紅-O固綠聯(lián)合染色，并用Mankin評分系統(tǒng)對各處理組進(jìn)行評分;(4)采用免疫組化方法比較各組

4、間Ⅱ型膠原、p-Akt及p-S6的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:1、體外實驗（模擬OA狀態(tài)的大鼠軟骨細(xì)胞部分）:黃連素可以顯著激活A(yù)kt/p70S6/S6通路，并促進(jìn)模擬OA狀態(tài)的大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活及增加基質(zhì)合成。2、體外實驗（人OA軟骨細(xì)胞部分）:黃連素可以激活A(yù)kt/p70S6/S6通路，并促進(jìn)入OA軟骨細(xì)胞存活及增加基質(zhì)合成;3、體內(nèi)試驗（SD大鼠OA模型）:黃連素可以激活A(yù)kt/p70S6/S6通路，增加基質(zhì)產(chǎn)生，增加軟骨層