G-GSF動員MSCs對嚴重顱腦創(chuàng)傷小鼠的救治作用與機制研究.pdf

1、顱腦創(chuàng)傷是戰(zhàn)時和平時常發(fā)生的嚴重傷類，救治尤其困難，傷亡和傷殘率為嚴重創(chuàng)傷之首。據(jù)報道，全世界每年至少有1千萬顱腦創(chuàng)傷病人。在美國，每年有1.4百萬顱腦創(chuàng)傷病人，死亡達5萬人。我國每年有百萬以上的嚴重顱腦創(chuàng)傷病人，其中死亡約10萬人，而存活傷員多并發(fā)傷殘?？梢?，顱腦創(chuàng)傷已成為全球嚴重的公共衛(wèi)生問題。如何降低死亡率、減少傷殘率是創(chuàng)傷醫(yī)學領域一直攻克的難題，取得了一些進展，特別是通過多種手段綜合救治，在一定程度上減輕或控制全身性損害的發(fā)生發(fā)

2、展，降低了死亡率。但對促進腦組織再生修復、神經(jīng)功能恢復尚未取得突破性進展，主要原因是神經(jīng)細胞再生極為困難。 以往認為神經(jīng)元細胞是終末分化的功能細胞，失去增殖能力。腦組織或脊髓組織損傷后的修復，主要由神經(jīng)膠質(zhì)細胞增殖修復，缺乏相應神經(jīng)元再生，這種不完全性再生導致神經(jīng)功能喪失，形成智殘或肢殘的嚴重后果。隨著干細胞研究的不斷深入，從腦組織中分離出神經(jīng)干細胞，體外培養(yǎng)有增殖活性，并可向神經(jīng)元細胞誘導分化，說明神經(jīng)組織中存在少量具增殖活性

3、的干細胞，可以通過體內(nèi)途徑增強其增殖并誘導向神經(jīng)元細胞分化，可能有利于損傷組織的結構修復和功能康復。也可以利用神經(jīng)干細胞具有體外增殖能力的特性，在體外將少量神經(jīng)干細胞擴增并定向誘導后移植到損傷部位，或靜脈移植隨血液循環(huán)到達損傷部位促進其修復。但在臨床應用中則難以實施，因為不可能從自體取材分離神經(jīng)干細胞，獲得異體神經(jīng)干細胞亦十分困難，胚胎干細胞涉及倫理學問題，加之異體細胞移植的免疫排斥問題、體外擴增后的細胞成瘤風險等問題遠未解決。

4、 然而，成體干細胞具多向分化潛能的理論認識，為再生醫(yī)學、創(chuàng)傷醫(yī)學等研究領域開創(chuàng)了新局面，拓展了新思路，奠定了新途徑。不少文獻報道，骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)具有可獲得性(自體或異體來源)、體外大量擴增性和體外誘導的多向分化性(成骨分化、成肌分化、成脂分化、成神經(jīng)細胞分化等)，本單位前期研究還證實，將綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠骨髓細胞靜脈移植給受10Gyγ線全身照射的同種小鼠(多臟器損傷模

5、型)，移植的GFP陽性骨髓細胞廣泛存在于受體小腸、肝、腦、皮膚等多種組織臟器，通過形態(tài)學結合免疫組化分析，有的移植細胞已轉化為小腸上皮細胞、肝細胞和神經(jīng)元樣細胞，又將原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)上清液加入MSCs培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)MSCs可轉化表達神經(jīng)元細胞的分子標志。綜合體內(nèi)體外結果分析認為，MSCs通過血液循環(huán)定植于損傷局部，并受局部壁龕微環(huán)境因素和體液因素調(diào)節(jié)分化為局部功能細胞。而生理情況下，MSCs大量存在骨髓，循環(huán)血液中僅有少量，如果采取措

6、施動員骨髓中的MSCsl進入血液循環(huán)，使定植于損傷局部的MSCs數(shù)量增加，并在微環(huán)境因素調(diào)節(jié)下分化為功能細胞，必將有利于創(chuàng)傷(包括顱腦創(chuàng)傷)組織修復和功能恢復。利用干細胞的生物學特性，切入創(chuàng)傷救治研究，探索促進創(chuàng)傷組織修復的實用新途徑并闡明相關機理，對揭示干細胞分化受微環(huán)境調(diào)控機制和推進臨床創(chuàng)傷救治具有重要意義。 因此，本課題第一部分建立從大鼠、人等不同種屬外周血分離培養(yǎng)MSCs的方法，以成纖維細胞集落形成單位(colonyfo

7、rmingunits-fibroblast，CFU-F)技術定量分析動物體內(nèi)注射粒細胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF)后，是否增加外周血MSCs數(shù)量，以明確G-CSF的動員效應，進一步分析經(jīng)動員進入外周血的MSCs是否保留骨髓MSCs的分子標志和多向分化潛能，尤其是闡明能否向神經(jīng)元細胞分化，有無神經(jīng)元細胞的電生理活動。第二部分自行改進制作顱腦撞擊傷致傷裝具，復制嚴重顱腦創(chuàng)

8、傷小鼠模型(50gx30cm撞擊力)，設計3種G-CSF劑量分別注射給3組致傷小鼠，觀測動物14天內(nèi)的累積死亡率，參照Bederson等評分方法和Shapira等評分方法對致傷小鼠分別進行神經(jīng)行為學評分和運動功能評分的動態(tài)觀測，從整體水平評估G-CSF動員骨髓細胞參與嚴重顱腦創(chuàng)傷的救治作用。由于G-CSF不僅可以動員骨髓MSCs進入血液循環(huán)，也可動員造血干祖細胞或其它細胞進入血液循環(huán)，參與顱腦創(chuàng)傷修復主要是哪類細胞?創(chuàng)傷局部主要是什么因

9、素吸引循環(huán)細胞定植?定植后的細胞在原位能否轉化為神經(jīng)細胞?這些問題還鮮未闡明。故設計第三部分實驗，Westernblot方法檢測對MSCs具趨化作用的基質(zhì)源性細胞因子-1(stromal-derivedfactor-1，SDF-1)表達量的變化，采用經(jīng)典方法將GFP轉基因骨髓細胞分為MSCs細胞、造血干祖細胞和其它細胞3類，分別移植給顱腦創(chuàng)傷小鼠，以確定參與顱腦創(chuàng)傷修復的細胞類型，用雙標(GFP和NeuN等神經(jīng)細胞標志分子)免疫組化鑒定

10、移植細胞的轉化類型，獲如下主要結果與結論。 1.對不同種屬進行外周血MSCs分離培養(yǎng)，成功率不同，其直接原因是生理條件下外周血中存在的MSCs量少導致的。在本實驗條件下，我們可以穩(wěn)定的直接分離培養(yǎng)出大鼠外周血的MSCs。 2.通過CFU-F分析，證實G-CSF可以有效對動員大鼠骨髓和外周血MSCs(接近4倍)，動員的外周血MSCs特性鑒定實驗顯示：其形態(tài)上和骨髓MSCs一致；并陽性表達MSCs的標志分子：CD44、CD7

11、3、CD90和CD106，不表達造血系的標志分子：CD31和CD45；并具有成骨、成脂和成神經(jīng)元的分化能力。證實其為真正的MSCs。 3.體外實驗證實，動員的MSCs可以在β-巰基乙醇、神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液和組合誘導劑(含生長因子和化學分子的雞尾酒似的混合誘導劑)誘導下向神經(jīng)元分化，表達神經(jīng)元標志分子：NF、NSE和NeuN。在神經(jīng)元原代培養(yǎng)上清液的誘導下，動員的MSCs還可出現(xiàn)功能上的改變：類似神經(jīng)元的內(nèi)向鈉電流。 4

12、.確定撞擊小鼠頭部的撞擊力為50gx30cm，建立穩(wěn)定的小鼠嚴重顱腦創(chuàng)傷模型，為下一步的實驗提供研究平臺。 5.通過在不同時相點觀察創(chuàng)傷小鼠的神經(jīng)行為學和運動功能的改變、累積死亡率及病理切片，發(fā)現(xiàn)注射G-CSF后，嚴重顱腦創(chuàng)傷小鼠在神經(jīng)行為學和運動功能上有顯著改善，累計死亡率顯著降低，從整體水平上證實G-CSF對嚴重顱腦創(chuàng)傷小鼠具有救治效應。并證實在本實驗條件下，G-CSF的最佳動員劑量為20μg/kg.d。 6.將GF

13、P轉基因C57BL/6小鼠骨髓細胞通過貼壁培養(yǎng)和磁珠分選分成3種細胞：MSCs、造血干細胞、其它類細胞，流式細胞儀檢測證實分選效果比較好。將分選的細胞移植到嚴重顱腦創(chuàng)傷小鼠，結果表明：在大腦組織中未發(fā)現(xiàn)GFP標記的造血干細胞和其它類細胞的定植。GFP標記的MSCs移植顱腦創(chuàng)傷小鼠后5d、10d、15d和20d，均在大腦發(fā)現(xiàn)GFP陽性細胞的表達。證實骨髓細胞中是MSCs參與了小鼠嚴重顱腦創(chuàng)傷的修復。 7.Westernblot檢測

14、撞擊傷小鼠創(chuàng)位不同時相點的SDF-1的表達，結果顯示，小鼠嚴重顱腦創(chuàng)傷后，創(chuàng)位腦組織的SDF-1高表達，顯著高于正常腦組織的SDF-1。在撞擊傷后7d，SDF-1的表達達到高峰。Westernblot檢測撞擊傷小鼠傷后第7d不同組織SDF-1的表達，結果顯示，小鼠嚴重顱腦創(chuàng)傷第7d后，創(chuàng)位腦組織的SDF-1高表達，顯著高于其他組織的SDF-1。其他組織中心臟的SDF-1表達最低。證實小鼠腦部創(chuàng)傷后可高表達SDF-1分子，吸引、趨化動員的

15、MSCs向腦損傷部位移行、定植。 8.NeuN為神經(jīng)元的特異標志分子，在核上表達。因此，用NeuN為一抗進行熒光免疫組化，可觀察到腦組織神經(jīng)元的分布情況。以熒光雙標免疫組化實驗來觀察GFP標記的MSCs在腦創(chuàng)位向神經(jīng)元(表達特異標志分子NeuN)的分化。結果顯示，第10d和20d的標本都可見同時表達NeuN分子和GFP分子的移植細胞，證實移植的GFP標記MSCs在腦創(chuàng)位向神經(jīng)元分化，從而參與嚴重顱腦創(chuàng)傷的修復。 9.以熒

16、光雙標免疫組化實驗觀察MSCs在嚴重顱腦創(chuàng)傷小鼠的創(chuàng)位向神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化。激光共聚焦顯微鏡結果顯示，第7d、12d和20d的標本都可見同時表達GFAP分子和GFP分子的移植細胞，表明移植的MSCs(GFP標記)還可通過在腦創(chuàng)位向神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化而促進嚴重顱腦創(chuàng)傷的修復。 10.基于上述研究結果，我們提出，對嚴重顱腦創(chuàng)傷傷員，采用G-CSF可有效動員骨髓間充質(zhì)干細胞進入血液循環(huán)，循環(huán)中的間充質(zhì)干細胞受損傷部位高表達SDF-1的吸