重組hIL-10質(zhì)粒構(gòu)建、真核表達及抗皮膚移植排斥的初步研究.pdf

1、目的：構(gòu)建hIL-10真核表達載體，探索在畢赤酵母中表達重組hIL-10蛋白，經(jīng)純化濃縮，獲得較高純度的目的蛋白并進行抗皮膚移植排斥的初步研究，為進一步研究hIL-10生物學功能和生物制品開發(fā)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：(1)設(shè)計PCR引物，以質(zhì)粒pORF-hIL-10為模板擴增hIL-10cDNA；(2)利用EcoRI/XbaI雙酶切目的基因，并亞克隆至同樣雙酶切的載體pPICZaA中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pPICZaA-hIL-

2、10，轉(zhuǎn)入E.coli DH5a進行質(zhì)粒擴增，小量抽提重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和DNA序列測定；(3)線性化重組質(zhì)粒pPICZaA-hIL-10，電轉(zhuǎn)化法，將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母，利用載體的ZeocinTM抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子；(4)對所獲陽性轉(zhuǎn)化子進行高抗性篩選、Mut表型和PCR鑒定；(5)利用甲醇誘導(dǎo)目的基因表達，收集培養(yǎng)上清，SDS-PAGE和Western-Blot法分析鑒定目的蛋白，ELISA法檢測目的蛋白表達水平；(6)用鎳離子親和

3、層析柱FF純化目的蛋白，聚乙二醇(PEG)濃縮后，SDS-PAGE、Bradford法和ELISA法分析純化產(chǎn)物中目的蛋白的純化效率；(7)設(shè)計同種異基因小鼠皮膚移植試驗，用提取的重組hIL-10蛋白通過皮下注射的用藥途徑，觀察重組蛋白對同種異基因小鼠皮膚移植排斥的影響。結(jié)果：(1)擴增出了hIL-10 cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在550bp處可見單一條帶，大小與預(yù)計相符合。用特異性引物測序， 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了hIL-10