環(huán)氧合酶-2與口腔鱗狀細胞癌關(guān)系的初步研究.pdf

1、目的: 口腔鱗狀細胞癌(oralsquamouscellcarcinoma，OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，約占口腔癌總數(shù)的80％以上，發(fā)病率高，生存率低，嚴重危害人類健康。研究表明，口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展不僅存在細胞的過度增殖，同時也存在細胞凋亡的抑制，凋亡和增殖的平衡失調(diào)在癌癥發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)是前列腺素(prostaglandin，PG)生物合成過程中一個重要的限速

2、酶，可將花生四烯酸(arachidonicacid，AA)代謝為各種前列腺素產(chǎn)物，從而參與機體的病理生理過程。近年來的研究表明，COX-2除了在炎癥中發(fā)揮重要作用外，還與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。COX-2促進腫瘤發(fā)生的機制之一，可能通過其下游生成的PGE2上調(diào)VEGF等血管生成因子的表達，進而參與腫瘤新生血管生成有關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)是一種高度特異性的血

3、管內(nèi)皮細胞有絲分裂因子，通過與其特異性受體(VEGFR)結(jié)合，引起一系列的信號轉(zhuǎn)導，釋放多種細胞與生長因子，刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進新生血管生成，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。 該實驗應(yīng)用環(huán)氧合酶-2抑制劑NS-398處理人舌鱗癌細胞系Tca8113，研究其體外抗增殖作用及其對細胞周期的影響，并且檢測環(huán)氧合酶-2及VEGF對口腔鱗癌細胞凋亡發(fā)生過程及新生血管生成的調(diào)節(jié)作用，借以探討環(huán)氧合酶-2與口腔鱗狀細胞癌的關(guān)系，為

4、進一步研究口腔鱗狀細胞癌的發(fā)病機理提供理論依據(jù)，為尋找更有效的口腔鱗癌治療方法提供新的思路。 實驗材料與方法: 1.免疫組化收集口腔鱗癌組織標本45例，白斑35例，正?？谇徽衬?2例，使用免疫組化S-P法，觀察COX-2及VEGF的表達。 2.VEGFmRNA及蛋白含量的表達檢測經(jīng)150μmol/LNS-398處理的人舌鱗癌細胞Tac8113中VEGFmRNA及蛋白的含量變化。 3.細胞培養(yǎng)Tca8113

5、細胞系用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，5％CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞形態(tài)變化。 4.MTT檢測法Tca8113細胞以0.5×104個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，實驗組細胞培養(yǎng)液濃度為：含25、50、75、100、125、150、200μmol/LNS-398的培養(yǎng)液，對照組細胞為含0.1％DMSO的培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(5m/ml)試劑20μl，37℃繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，每孔加入DM

6、SO150μl，震蕩10min，用酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處測定每孔吸光度值(OD)。 抑制率(％)=(1-處理組OD值/對照組OD值)×100％5.細胞形態(tài)學觀察 (1)倒置相差顯微鏡取含0、150μmol/LNiS-398的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h、72h、96h后于倒置相差顯微鏡下觀察細胞大體形態(tài)改變并照相;(2)透射電鏡培養(yǎng)細胞用胰酶消化后，PBS洗兩次，1000rpm，4℃，6’離心，2.5％戊二醛固定用于透射電鏡觀察。

7、 6.流式細胞儀測定細胞周期細胞以1×106個/孔接種于6孔培養(yǎng)基中，用含0、150μmoL/LNS-398的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48-96h，收集貼壁生長的細胞制成單細胞懸液，PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)溶液，避光4℃作用20-30min，用流式細胞儀檢測，結(jié)果用細胞周期分析軟件(ModFitLT3.0)進行分析。 7.RT-PCR取150μmol/LNiS-398作用的人舌鱗癌細胞Tca8113培養(yǎng)72小時后，檢測其凋亡相

8、關(guān)基因Bcl-2、bax、survivinmRNA水平的變化。 8.WesternBlot印跡分析樣品采用考馬斯亮藍法定量蛋白，檢測150μmol/LNS-398作用的人舌鱗癌細胞Tca8113中凋亡相關(guān)基因Bcl-2、bax、survivin蛋白水平的變化。 實驗結(jié)果: 1.COX-2、VEGF在鱗癌及白斑中的表達口腔鱗癌及白斑組織中細胞胞漿及胞膜中均有COX-2、VEGF的表達，表達強度在高分化鱗癌中最強，依

9、次為中分化鱗癌、低分化鱗癌、白斑，正?？谇徽衬ぽp微表達。采用方差分析，各組間差異具有顯著性(F=147.53，P＜0.001)。 2.VEGFmRNA及蛋白的含量表達150μmol/LNS-398作用的人舌鱗癌細胞Tca8113VEGFmRNA及蛋白的含量隨作用時間的延長逐漸下降(F=23.26，P＜0.001，F(xiàn)=99.52，P＜0.0001)。 3.細胞培養(yǎng)人舌鱗癌細胞Tca8113經(jīng)NS-398處理后隨著用藥時間的

10、延長和用藥濃度的增加，細胞形態(tài)出現(xiàn)不規(guī)則，細胞間隙逐漸增寬，體積逐漸縮小。 4.MTT法NS-398對人舌鱗癌細胞Tca8113的抑制作用呈劑量依賴性和時間依賴性。藥物濃度：F=16.88，P＜0.05；時間：F=199.44，P＜0.00l。 5.透射電鏡人舌鱗癌細胞Tca8113經(jīng)150μmol/LNS-398作用72小時后，電鏡下可見典型的凋亡細胞特征：染色質(zhì)邊聚、濃縮。 6.流式細胞儀測定細胞周期COX-

11、2抑制劑NS-398可引起人舌鱗癌細胞Tca8113G0/G1期細胞的大量增加，S期和G2/M期細胞比例數(shù)減少，阻滯細胞生長于G0/G1期(P＜0.001)。 7.BT-PCR隨著COX-2抑制劑NS-398作用時間的延長，人舌鱗癌細胞系Tca8113中凋亡相關(guān)基因Survivin和Bcl-2的mRNA表達水平逐漸降低，Bax表達逐漸升高，差異顯著(P＜0.001)。 8.Western印跡分析隨著COX-2抑制劑NS-

12、398作用時間的延長，人舌鱗癌細胞系Tca8113中凋亡相關(guān)基因Survivin和Bcl-2的蛋白表達水平逐漸降低，Bax表達逐漸升高，差異顯著(P＜0.001)。 結(jié)論: 1.COX-2及VEGF在口腔鱗癌組織高表達，其表達的改變在從正常組織到上皮異常增生，再到鱗癌的轉(zhuǎn)變中有明顯差異。 2.口腔鱗癌組織中COX-2與VEGF表達呈顯著正相關(guān)。 3.選擇性COX-2抑制劑NS-398可使體外培養(yǎng)的人舌鱗癌

13、細胞Tca8113VEGF的mRNA和蛋白表達水平下降，且呈時間依賴性。 4.選擇性COX-2抑制劑NS-398可抑制體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細胞Tca8113的增殖，并具有時間和濃度依賴性。 5.選擇性COX-2抑制劑NS-398可以使體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細胞Tca8113細胞阻滯于細胞周期G0/G1期。 6.選擇性COX-2抑制劑NS-398可誘導體外培養(yǎng)的人舌鱗癌細胞Tca8113細胞凋亡。 7.COX-2