豬瘟病毒P80基因的真核表達(dá)及p80蛋白對(duì)PK-15細(xì)胞致病變作用的研究.pdf

1、中文摘要豬 瘟病毒P 8 0 基因 的 真 核表達(dá)及P 8 0 蛋白 對(duì) P K - 1 5 細(xì)胞致病變作用的研究摘 要利用反轉(zhuǎn)錄P C R ( R T - P C R ) 和套式P C R ( n P C R ) 技術(shù)， 從豬 瘟病毒S h i m e n 株細(xì) 胞毒中克隆 出P 8 0 基因， 并進(jìn) 一步 把P 8 0 基因 連 接 在 真 核表 達(dá) 載體p E G F P - C 1 上， 成功 地 構(gòu)建出P 8 。 基因 重組

2、真核表達(dá)質(zhì)粒 ( p E G F P - P 8 0 ) ， 為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 表達(dá)并 純化出p 8 0 蛋白 奠定了 基礎(chǔ)。 接著， 把構(gòu)建 好的 重組 質(zhì) 粒p E G F P - P 8 0 在P K - 1 5 細(xì)胞中 進(jìn)行表達(dá)來 研究p 8 。 蛋白 對(duì)P K - 1 5 細(xì)胞的 致病變作用， 為研究p 8 0 蛋白 與 豬源細(xì)胞發(fā)生C P E 效 應(yīng)之間的聯(lián)系進(jìn)行了探討。1 . 參考已 經(jīng)發(fā)表的豬瘟病毒A l f o r

3、t 株和B r e s c i a株的全基因 組序列， 設(shè)計(jì)2 對(duì)引 物P l / P 2 和B l / B 2 ， 在B 1 和B 2 的5 ' 端 分 別引 入X h o I 和A p a I 酶 切 位點(diǎn)， 使 用R N A 一步提取試劑盒， 利用 R T - P C R和n P C R技術(shù)， 成功地從豬瘟 S h i m e n 株細(xì)胞毒中 擴(kuò)增出約2 . O k b 大小的P 8 0 基因。 將P C R 產(chǎn) 物分離

4、、 純化并與克隆載體p M D 1 8 - T 連接， 然后進(jìn)行核昔酸序列測(cè)定和 P C R , B a r n h I / H i n d I I I 雙酶切的鑒定， 結(jié)果表明其為P 8 0 基因的重組質(zhì) 粒 ( p M D - P 8 0 ) 。 將p M D - P 8 0 分 別經(jīng)X h o I 和A p a I 雙酶 切和回收， 然后與 經(jīng) 過X h o I 和A p a I 酶解的真核表達(dá) 載體p E G P

5、 F - C 1 連接、 轉(zhuǎn)化， 獲 得重組質(zhì)粒， 經(jīng)P C R ,X h o I 和J 勺 J a I 限 制 性酶 切 和 序 列 測(cè)定， 鑒 定 為 真核 表 達(dá) 質(zhì) 粒p E G F P - P 8 0 ， 并 且目 的 基 因的 插入 位置、 方向 和讀 碼框完全正 確， 為 在哺 乳動(dòng) 物細(xì)胞中 表達(dá)并分離 純化p 8 0 蛋白 奠定了 基礎(chǔ)。2 . 利 用陽(yáng) 性脂 質(zhì)體L 2 0 0 0 介 導(dǎo)， 在 六 孔 細(xì) 胞

6、 培 養(yǎng) 板中 ， 將已 經(jīng) 構(gòu)建 好的p E G F P - P 8 0重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到 P K - 1 5細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在轉(zhuǎn)染后 6 h ，利用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)到發(fā)出 綠色熒光的 融合蛋白 ; 在轉(zhuǎn)染后2 4 h ， 利 用免疫組化S A B C 法 檢測(cè)到目 的 蛋白p 8 0 .結(jié) 果 表明 ， 重 組表 達(dá)質(zhì) 粒p E G F P - P 8 0 可以 在P K - 1 5 細(xì) 胞中 表 達(dá)出 有 免 疫活 性的p 8 0

7、蛋白 。 重復(fù)轉(zhuǎn)染操作， 在 % 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 將 p E G F P - P 8 0重組表達(dá)質(zhì)粒和空 質(zhì)粒p E G F P - C 1分別轉(zhuǎn)染到 P K - 1 5細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。分別在轉(zhuǎn)染后 2 4 h . 4 8 h對(duì)轉(zhuǎn)染了p E G F P - P 8 0 質(zhì)粒的 細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染了 空 質(zhì) 粒p E G F P - C 1 的 細(xì)胞組 進(jìn)行M T T 比 色， 測(cè)定O D值， 并 進(jìn)行兩 組細(xì)胞活性分析。 結(jié)果表明，

8、利用p E G F P - P 8 0 重組表達(dá)質(zhì)粒在P K - 1 5 細(xì)胞中 表達(dá)出 的P 8 。 蛋白 未 對(duì)宿主細(xì) 胞有明 顯的 致 病變作用。關(guān)鍵詞:豬瘟， P 8 0 基因，真核表達(dá)， P K - 1 5 細(xì)胞，致細(xì)胞病變作用I I I 英文摘要a r e r e s p e c t i v e l y t r a n s f e c t e d i n t o t h e t w o g r o u p s

9、o f P K - 1 5 c e l l s . T h e f i s t i s t h e t e s t i n g g r o u p ,a n d t h e s e c o n d i s t h e c o n t r o l . R e s p e c t i v e l y , d u r i n g t h e 2 4 h a n d 4 8 h a f t e r

10、t h e t r a n s f e c t i o n , t h et w o g r o u p s o f c e l l s a r e s t a i n e d b y MT T a n d m e n s u r a t e d O D w h e n t h e a b s o r p t i o n w a v e l e n g t hi s 6 3 0 n m . B o

11、t h a c t i v i t i e s o f t h e t w o g r o u p s o f t h e c e l l s a r e a n a l y s i z e d . W i t h t h e c o m p a r i t i o no f t h e t w o g r o u p s , t h e c o n c l u s i o n c a n b e

12、 d r a w n t h a t t h e p 8 0 p r o t e i n e x p r e s s e d b y t h e p l a s m i dp E G F P - P 8 0 c a n n o t c a u s e t h e d e t e c t a b l e d e p r e s s i o n o f a c t i v i t y o f P K -