奶牛乳腺炎三聯(lián)苗田間試驗(yàn)及牛源無(wú)乳鏈球菌CAMP因子的克隆表達(dá).pdf

1、用篩選到的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌疫苗株甲醛滅活后，選用合適的佐劑制備乳腺炎三聯(lián)苗，經(jīng)過(guò)理化性質(zhì)鑒定、無(wú)菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)。對(duì)小鼠免疫三次后采血，用全菌包被ELISA試驗(yàn)檢測(cè)鼠血清抗體，結(jié)果表明采用油佐劑制成的奶牛乳腺炎三聯(lián)苗物理性狀穩(wěn)定能有效激發(fā)小鼠產(chǎn)生抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌的血清抗體。 為評(píng)價(jià)奶牛乳腺炎三聯(lián)油乳劑滅活疫苗防制奶牛乳腺炎的效果，我們進(jìn)行了疫苗接種田間試驗(yàn)。為評(píng)價(jià)疫苗免疫效果建立了金黃色

2、葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌菌體包被酶標(biāo)板檢測(cè)血清抗體效價(jià)的間接ELISA檢測(cè)方法。在對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ蚊庖吆髾z測(cè)牛血清抗體效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組血清抗體效價(jià)與對(duì)照組相比有明顯提高。免疫乳清體外抑菌試驗(yàn)的結(jié)果表明乳清中較高的特異性抗體確實(shí)能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無(wú)乳鏈球菌的生長(zhǎng)。 提取能產(chǎn)生CAMP反應(yīng)的牛源無(wú)乳鏈球菌山東分離株的基因組DNA，PCR擴(kuò)增CAMP因子基因，重組到pMD18-T載體中。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增片斷含有

3、768bp的開放讀碼框(Open reading frame，ORF)，可編碼含255個(gè)氨基酸的成熟蛋白，與已報(bào)道的無(wú)乳鏈球菌CAMP因子蛋白的氨基酸組成相比，第8位Tyr→Cys，第95位Pro→Ser，第126位Thr→Ala的3個(gè)氨基酸發(fā)生了點(diǎn)突變，同源性為98.4％。成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a+/cfb，SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)表達(dá)水平，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白分子量為48kD，表達(dá)量占菌體總蛋白的52.7％。這為進(jìn)