14250.皮狀絲孢酵母培養(yǎng)條件及油脂積累所需nadph來源的初步研究

1、分類號(hào)：Q93c797密級(jí)：UDC：華東理工大學(xué)學(xué)位論文皮狀絲孢酵母培養(yǎng)條件及油脂積蒿珍珍指導(dǎo)教師姓名：花強(qiáng)教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)名稱：生物化工論文定稿日期至Q!墨121嬰論文答辯日期：2013222學(xué)位授予單位：學(xué)位授予日期：華東理工大學(xué)越并3曩jo西’’、J‘答辯委員會(huì)主席：評(píng)閱人：許建和鮑杰趙權(quán)宇華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁皮狀絲孢酵母培養(yǎng)條件及油脂積累所需NADPH來源的初步研究摘要面對(duì)整個(gè)世界能源

2、供應(yīng)緊缺和能源環(huán)境問題，環(huán)保高效的生物能源的發(fā)展是必然的。近年來，以微生物油脂為原料的生物柴油的生產(chǎn)由于生產(chǎn)成本較低、油脂成分與植物油相似而受到社會(huì)各界廣泛關(guān)注。本課題選用油脂酵母皮狀絲孢酵母(乃f如D冊(cè)，D”c“幻玎P“mACCC20271)為實(shí)驗(yàn)菌株，在合成培養(yǎng)基中對(duì)其發(fā)酵條件(碳氮比、溶氧、初始pH等)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了適合該菌株生長和產(chǎn)油的最優(yōu)條件，為研究該菌株的油脂合成調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，針對(duì)油脂積累過程中所需還原力(NA

3、DPH)的來源問題，本實(shí)驗(yàn)從酶活、轉(zhuǎn)錄和生化等不同水平來研究蘋果酸酶(ME)催化的反應(yīng)和磷酸戊糖(PP)途徑所產(chǎn)生的NADPH對(duì)油脂積累的貢獻(xiàn)程度，為進(jìn)一步探索油脂微生物的油脂合成機(jī)理提供可靠的依據(jù)。1對(duì)本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)油培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后得出，最適合該菌株生長和產(chǎn)油的碳氮比為825(Cmol／Nm01)；此時(shí)菌體量(117∥L)較原始條件提高了將近40％，產(chǎn)油量(376∥L)也較原始條件提高了30％以上，說明這些條件對(duì)菌體的高密度培養(yǎng)是很重要

4、的。另外菌體的含油率可能受到其它因素(還原力等)的限制，有待通過其他手段來進(jìn)一步探究影響菌體油脂積累能力的因素。此外，實(shí)驗(yàn)還表明該菌株合成油脂的成分含量與葵花籽、玉米油等油脂中脂肪酸含量相似，是很好的生物柴油原料生產(chǎn)菌。2針對(duì)油脂酵母內(nèi)產(chǎn)生NADPH的兩個(gè)途徑——ME催化的反應(yīng)和PP途徑，通過研究關(guān)鍵酶ME和G6PDH的活性變化與油脂積累程度的關(guān)聯(lián)性來進(jìn)一步揭示油脂積累的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)表明，氮限條件下細(xì)胞培養(yǎng)至18h左右氮源耗盡，油脂合成機(jī)

5、制啟動(dòng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該條件下，在油脂快速積累時(shí)細(xì)胞內(nèi)的蘋果酸酶活性相對(duì)于菌體快速增長期增長了約25倍，；而在氮源充足條件下該酶的活性無明顯變化，說明蘋果酸酶催化的蘋果酸氧化脫羧反應(yīng)與油脂的大量合成緊密相關(guān)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)在氮限條件下，油脂合成期的葡萄糖一6磷酸脫氫酶活性較菌體快速生長期也有一定程度的提高，但與氮源充足條件下該酶活性的變化相比并無明顯提高，表明戊糖磷酸途徑流量的變化與皮狀絲孢酵母中油脂代謝沒有明顯的關(guān)聯(lián)性。3實(shí)驗(yàn)通過CODEHO

6、P引物設(shè)計(jì)和簡并PCR方法對(duì)皮狀絲孢酵母體內(nèi)的ME和G6PDH的編碼基因聊P和耐進(jìn)行克隆，得到了這兩個(gè)基因的部分序列信息。為后續(xù)油脂積累的分子水平的深入研究奠定基礎(chǔ)。4qRTPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mP在轉(zhuǎn)錄水平上并不受到氮源限制條件的調(diào)節(jié)，說明在油脂積累過程中ME活性的迅速升高是一系列復(fù)雜調(diào)控的結(jié)果，而不是單一基因的調(diào)節(jié)；斫在轉(zhuǎn)錄水平上同樣不受氮源限制條件的調(diào)控，并且在油脂積累期其相對(duì)轉(zhuǎn)錄量顯著下降，說明了G6PDH主要是在菌體的快速生長