金針菇色澤基因的分子標(biāo)記技術(shù)研究.pdf

1、色澤是金針菇的重要性狀之一,受一對等位基因的控制.該研究以FLl9(黃色)、8801(白色)及其后代(F1代、F2代)菌株和相應(yīng)單核菌株為材料,通過對金針菇DNA提取方法和RAPD擴(kuò)增條件的優(yōu)化,建立了一套適于金針菇RAPD反應(yīng)的反應(yīng)體系:在此基礎(chǔ)上,通過RAPD分析和BSA法相結(jié)合,成功的篩選到一個與金針菇白色基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記S3751800,并根據(jù)序列分析結(jié)果將RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的SCAR分子標(biāo)記.主

2、要結(jié)果如下:1.DNA提取條件優(yōu)化通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計,在4個因子(菌絲培養(yǎng)方式、菌絲處理方式、氯化芐濃度、SDS濃度)的3個水平共9個處理方面對氯化芐法提取DNA進(jìn)行了探討,所提取的DNA在OD260處的數(shù)據(jù)結(jié)果和電泳結(jié)果均顯示,處理3(菌絲靜止培養(yǎng),液氮研磨,氯化芐濃度為5ml/g菌絲,SDS濃度為20％)效果明顯優(yōu)于其它8個處理.2.RAPD擴(kuò)增條件優(yōu)化運(yùn)用單因素篩選方法,分別對不同的Mg2+濃度、模板DNA濃度、引物濃度、dNTP濃

3、度、Taq酶濃度以及不同的退火溫度進(jìn)行了篩選,最后得到金針菇PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系為:2.5μl Buffer,2mM MgCl2,50ng DNA,0.2 μM Primer,100uM dNTP,1.25U Taq酶,最后用無菌超純水補(bǔ)至25u 1.3.色澤基因的RAPD標(biāo)記篩選 根據(jù)BSA法的原理,分別從黃、白色菌株中選取5株(單核4株,雙核1株),提取菌絲DNA混合組成兩個基因池,然后用200個10堿基對的隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD

4、多態(tài)性分析,篩選到一個穩(wěn)定的多態(tài)性標(biāo)記S3751800,通過對FL19、8801及其后代共75株單核菌株和13株雙核菌株的驗(yàn)證,證明該標(biāo)記與白色基因是緊密連鎖的.4.RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記對上述RAPD標(biāo)記S3751800片段進(jìn)行了克隆和兩端測序,并根據(jù)序列分析結(jié)果將上述RAPD分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的SCAR分子標(biāo)記.利用該標(biāo)記對F1代單核菌株,以及不同來源的32個雙核菌株和其中6株的90個單核菌株分別進(jìn)行了驗(yàn)證,證