雞球蟲3-1E和CDPK基因工程苗的研制及其免疫保護(hù)效果.pdf

1、球蟲病是危害養(yǎng)禽業(yè)的一類嚴(yán)重的寄生蟲病,在抗球蟲免疫反應(yīng)中,細(xì)胞免疫反應(yīng)所起的作用要大于體液免疫的作用,為了研究核酸疫苗和重組蛋白疫苗對(duì)雞球蟲病的防治效果,進(jìn)行了以下試驗(yàn):1.球蟲子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)的克隆:分別以E.tenella GS和E.acervulina QH株孢子化卵囊總RNA為模板,按照GenBank發(fā)表的序列合成引物,進(jìn)行RT-PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T Easy載體連接后,轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)

2、細(xì)胞,將PCR和酶切鑒定正確的陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序.結(jié)果表明,擴(kuò)增的兩個(gè)蟲株的3-1E基因的ORF大小均為513bp,共編碼171個(gè)氨基酸,Et GS 3-1E與文獻(xiàn)報(bào)道的Ea 3-1E同源性為99.6﹪,Ea QH 3-1E與文獻(xiàn)報(bào)道的Ea 3-1E同源性為99.2﹪,Et GS 3-1E與Ea QH 3-1E同源性為99.6﹪;Et GS CDPK的ORF為1470個(gè)堿基,共編碼490個(gè)氨基酸,與文獻(xiàn)報(bào)道的Et CDPK同源性為99.6

3、﹪.2.基因的表達(dá)與純化:按照pGEX-6P1表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn),重新設(shè)計(jì)添加相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物,進(jìn)行Et.GS株3-1E和CKPK基因的亞克隆,將亞克隆的基因與表達(dá)載體進(jìn)行酶切后連接,將鑒定正確的陽(yáng)性菌落轉(zhuǎn)化其宿主菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并將表達(dá)產(chǎn)物通過GST純化柱進(jìn)行了純化.通過SDS-PAGE表明,在加入IPTG誘導(dǎo)劑5h左右即可達(dá)到較高水平的表達(dá),其中pGEX-3-1E表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的43.3﹪,pGEX-CDPK表達(dá)產(chǎn)

4、物占菌體總蛋白的35.4﹪.表達(dá)的融合蛋白均為可溶性蛋白,將超聲裂解后的上清直接過柱純化,得到了高純度的重組蛋白.3.真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)檢測(cè):將所克隆的3-1E、CDPK基因以及IFN-γ單獨(dú)或串連于真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Zeo(+),成功構(gòu)建了單價(jià)、雙價(jià)和三價(jià)的真核重組質(zhì)粒;pcI、pcC、pcE、pcCE、pcEI、pcCEI等7種.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將pcE和pcC真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入BHK細(xì)胞,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的

5、細(xì)胞,提取細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄之后使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄情況,瓊脂糖電泳檢測(cè)到各自的特異性條帶,說(shuō)明pcE和pcC真核重組質(zhì)?？稍谡婧思?xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白.4.真核表達(dá)質(zhì)粒和重組蛋白的免疫原性研究及體內(nèi)表達(dá)檢測(cè):采用MTT法對(duì)構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒和重組蛋白進(jìn)行了淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),研究表明,在一免后7天,各免疫組淋轉(zhuǎn)水平均有不同程度的提高,在二免后7天和感染后7天,各免疫組淋轉(zhuǎn)水平有顯著性提高,說(shuō)明隨著免疫時(shí)間

6、的延長(zhǎng)及加強(qiáng)免疫后,各免疫組具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)雞的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力.通過對(duì)pcE和pcC免疫組肌肉組織基因組DNA的提取、總RNA的提取,反轉(zhuǎn)錄、PCR鑒定結(jié)果表明,核酸疫苗至少可在體內(nèi)存在并持續(xù)表達(dá)1個(gè)月.5.真核表達(dá)質(zhì)粒和重組蛋白對(duì)球蟲感染雞的保護(hù)研究:在每次核酸疫苗免疫雞只前對(duì)注射部位進(jìn)行25﹪蔗糖的預(yù)處理,間隔一周兩次免疫,二兔后7天攻擊3×10<'4>個(gè)Et GS卵囊,7天后殺雞觀察免疫組的保護(hù)效果.結(jié)果表明,免疫組與感染對(duì)照組