熒光假單胞菌遺傳標(biāo)記及工程菌生物安全性評價(jià).pdf

1、生防微生物良好的田間定殖、存活和生存競爭能力是穩(wěn)定發(fā)揮防效的重要前提,而對在環(huán)境中使用的活體重組微生物而言,其生存競爭能力是轉(zhuǎn)基因生物安全性評價(jià)關(guān)注的重要內(nèi)容.近年來新型報(bào)告基因已成為研究微觀與宏觀生命現(xiàn)象的有效工具,新的研究方法和技術(shù)的興起也為探明工程菌的生物安全性提供了有效手段.該研究對攜帶P<,A1/04/03>啟動子、gfp基因、mini-Tn5轉(zhuǎn)座子的pJBA28質(zhì)粒進(jìn)行改造,構(gòu)建了含熒光假單胞菌自身啟動子P<,P303>的中

2、間質(zhì)粒載體pGFP.然后利用mini-Tn5轉(zhuǎn)座子,通過接合轉(zhuǎn)移,將兩個帶有不同啟動子的綠色熒光蛋白基因分別整合到熒光假單胞菌P303染色體上,獲得了在488nm波長下發(fā)光穩(wěn)定的P303ml和P303m3菌株.PCR鑒定和Southern印跡結(jié)果均證明綠色熒光蛋白已隨機(jī)插入P303染色體.SDS-PAGE結(jié)果表明含有P<,A1/04/03>啟動子的P303m3菌株GFP表達(dá)量低于含有PP303啟動子的P303ml菌株,染色體標(biāo)記的GFP

3、表達(dá)量低于質(zhì)粒標(biāo)記.此外還發(fā)現(xiàn)低溫有利于GFP的表達(dá).生長曲線測定結(jié)果表明P303ml與P303生長特性無顯著差別.遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明96小時綠色熒光蛋白基因穩(wěn)定性為100％.同時利用電擊轉(zhuǎn)化方法獲得含有Bt殺蟲蛋白基因的三價(jià)熒光假單胞菌工程菌BioP8,室內(nèi)生測數(shù)據(jù)表明對小菜蛾毒力較高.室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明P303m3、BioP8與出發(fā)菌株P(guān)303抑菌活性相當(dāng),對白菜黑斑、黃瓜灰霉、蘿卜褐腐、油菜立枯、油菜菌核、黃瓜炭疽、煙草赤星

4、青霉等植物病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用.利用微生物選擇性分離培養(yǎng)技術(shù)和PCR鑒定方法,研究了P303、P303ml、BioP8菌株在非限菌環(huán)境下不同生境的生存競爭能力:在溫室自然土壤中,40天內(nèi)供試菌株群落總量基本維持在10<'4>~10<'6>CFU/g土(濕重)之間,土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌總量在10<'8>CFU/g土(濕重)左右;在大白菜根際,30天以內(nèi)供試菌株可維持在10<'5>CFU/g根(濕重)以上,根圍可培養(yǎng)細(xì)菌總量約在10<'8~

5、10>CFU/g根之間;在大白菜葉面,處理后第3天P303、BioP8的菌量迅速由10<'5>CFU/cm<'2>葉片降至最低(10<'3>和10<'2>CFU/cm<'2>葉片左右),之后回升并以(10<'4>和10<'3>)CFU/cm<'2>葉片維持一段時間(第5-15天),葉面可培養(yǎng)細(xì)菌總量在10<'3>-10<'6>CFU/cm<'2>葉片之間波動.P303及其工程菌株在溫室自然土壤、田間大白菜根際和葉面的定殖時間至少分別為6

6、0、50和15天,工程菌株生存競爭能力弱于天然菌株,它們的消長動態(tài)相似,一個生長季(120天)后沒有檢測到長期殘留或重組質(zhì)粒擴(kuò)散,表明工程菌株具有良好的安全性.研究發(fā)現(xiàn)供試菌株在溫室自然土壤、田間大白菜根際的定殖能力明顯強(qiáng)于葉面,BioP8定殖能力弱于出發(fā)菌P303.建立了一套有效提取土壤、葉面細(xì)菌總DNA的方法,土壤總DNA提取量可達(dá)到10ugDNA/g土(濕重);利用PCR/DGGE技術(shù),對土壤和葉面細(xì)菌總DNA 16S rDNA