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文檔簡介
1、汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文題目:目:胰島素陽性及陰性細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建胰島素陽性及陰性細(xì)胞雙標(biāo)記系統(tǒng)的構(gòu)建英文題目:英文題目:Generationofaduallabelingsystemfinsulinpositivenegativecells姓名:范文竹學(xué)號(hào):10808066學(xué)院:理學(xué)院導(dǎo)師:魏熾炬教授專業(yè):生物化學(xué)與分子生物學(xué)入學(xué)日期:2008年9月答辯日期:2011年5月汕頭大學(xué)碩士學(xué)位論文I摘要細(xì)胞標(biāo)記與追蹤是研究胰腺發(fā)育與再生的
2、一種重要手段。傳統(tǒng)的CreloxP細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)需要兩個(gè)質(zhì)粒,其中一個(gè)用于組織特異性表達(dá)重組酶Cre,另一個(gè)用于組成型表達(dá)報(bào)告基因,但該系統(tǒng)目前只能用于單一種類細(xì)胞的標(biāo)記。為進(jìn)一步改善細(xì)胞標(biāo)記技術(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素陽性、陰性細(xì)胞的雙標(biāo)記,本研究設(shè)計(jì)了一種新的單載體系統(tǒng),該載體利用大鼠胰島素啟動(dòng)子(RIP)控制重組酶Cre的表達(dá),利用組成型CMV強(qiáng)啟動(dòng)子控制另一個(gè)重組酶Flp、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)、紅色熒光蛋白基因(DsRed)、及綠
3、色熒光蛋白基因(EGFP)的表達(dá)。同時(shí),在重組酶Cre及Flp的編碼區(qū)內(nèi)部各插入一個(gè)內(nèi)含子,以消除質(zhì)粒制備過程中外源基因的非特異性表達(dá),從而使胰島素陽性、陰性細(xì)胞分別被標(biāo)記為綠色和紅色。在該載體的構(gòu)建過程中我們發(fā)現(xiàn),由于Cre酶的放大作用,RIP的組織特異性顯著降低。為提高RIP的組織特異性,本研究探討了加快Cre在細(xì)胞內(nèi)的分解速度,降低Cre在細(xì)胞中的表達(dá)量,或減弱Cre的酶活性等途徑。研究結(jié)果表明,Cre基因173位精氨酸突變?yōu)榻M氨
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