芍藥在杭州栽培的耐熱評價及地下芽休眠機理研究.pdf

1、芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）在中國被認知和栽培已經(jīng)接近4000年，伴隨了大半個中華民族文明史。華北、西北和東北等地區(qū)是芍藥分布或栽培較為繁盛的地帶，但以浙江為代表的江南地區(qū)卻難以見到芍藥的大量推廣使用。如同“梅花北移”一樣，“芍藥南移”也是著名的園林植物學、觀賞園藝學和風景園林學問題，讓芍藥花繽紛江南大地，是利國利民、功在千秋之舉。本研究以菏澤芍藥和浙江的‘杭白芍’為研究對象，對芍藥在杭州的園林應用現(xiàn)狀、引種

2、栽培、高溫脅迫下的生理生化響應、耐熱性評價、生長適應性評價、打破地下芽休眠的需冷量、花期調(diào)控、芽休眠的轉錄組測序、休眠相關差異基因表達、南北芍藥雜交育種等，展開了為期4年的研究，希望能夠為“芍藥南移”的實現(xiàn)做出貢獻。
　　1、芍藥在杭州的園林應用和4年引種栽培
　　相比牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），芍藥在杭州公園綠地中的品種、配置手法和形成特色景觀的數(shù)量均非常少。西湖花港觀魚公園芍藥圃是栽培芍

3、藥最集中的區(qū)域，但也存在著嚴重的生長與開花退化現(xiàn)象。芍藥在杭州等江南園林中難以推廣使用，主要原因有:
　　(1)江南冬季溫度較高，導致需冷量無法滿足，萌芽、生長和開花受影響;(2)春季溫度較高，導致花莖徒長和“垂頭”，花期過短;(3)夏季酷熱潮濕，引發(fā)莖葉嚴重日灼、熱害和孳生病蟲害等。培育低需冷量、花型簡單、花莖粗壯、耐熱性好的本土品種，結合有針對性的科學研究、新品種推廣和工廠化生產(chǎn)，是實現(xiàn)“芍藥南移”的重要環(huán)節(jié)。
　　為實

4、現(xiàn)“芍藥南移”，引種是第一個工作環(huán)節(jié)。本研究在杭州引種了29個菏澤芍藥品種和浙江本土藥用的杭白芍，并開展為期4年的生長發(fā)育年周期觀測，指標涵蓋萌芽、生長、開花和枯萎等各個環(huán)節(jié)。結果，發(fā)現(xiàn)‘杭白芍’、‘觀音座’、‘奇花霜露’等生長和開花性狀較好，適合杭州地區(qū)推廣使用，而‘紅錦球’、‘巧玲’、‘五花龍玉’等品種的生長和開花性狀較差?！及咨帧姆诸惿写鏍幾h，在本研究中暫時被作為一個品種看待。
　　2、高溫脅迫下的生理生化響應和耐熱性、

5、生長適應性綜合評價
　　利用熱害指數(shù)、相對葉綠素含量和半致死溫度對30個芍藥品種進行初步的耐熱評價，發(fā)現(xiàn)‘杭白芍’、‘楊妃出浴’和‘紅金剛’的耐熱性最強，‘巧玲’、‘大富貴’和‘睛雯’的耐熱性最弱。對其中的10個品種進行了熱脅迫下的生理生化測定，強耐熱品種的相對電導率(relative electrical conductivity，REC)和丙二醛含量（malondialdehyde content, MDA）較低，相對含水量(

6、relative water content，RWC)、葉綠素含量(chlorophyll content，CC)、可溶性糖含量(soluble sugar content, SSC)、可溶性蛋白含量(soluble protein content，SPC)、抗壞血酸過氧化物酶活性（ascorbate peroxidase activity，APX）、最大熒光(Fm)、PSⅡ最大光能轉換效率（Fv/Fm）、PSⅡ光和電子傳遞量子效率(Φ

7、PSⅡ)、光化學淬滅系數(shù)(qP)和表觀光和電子傳遞速率(ETR)等均較高，超氧化物歧化酶活性(superoxidedismutase activity, SOD)變化不穩(wěn)定。
　　利用隸屬函數(shù)法和隸屬函數(shù)結合主成分分析法評價具有代表性的10個芍藥品種耐熱性，發(fā)現(xiàn)本土種質‘杭白芍’和植株密布白毛的‘楊妃出浴’耐熱性較強，‘晴雯’和‘大富貴’耐熱性較差。利用層次分析法評價綜合生長適應性，發(fā)現(xiàn)‘奇花霜露’、‘杭白芍’和‘山河紅’是表現(xiàn)最

8、好的品種，值得在杭州等江南地區(qū)園林中予以推廣使用，或優(yōu)先用作親本，培育江南品種;‘巧玲’、‘晴雯’和‘紅錦球’是表現(xiàn)最差的品種。層次分析法評價芍藥引種后的生長適應性，是建立在4年引種觀測、耐熱實驗和評價、雜交育種實踐等數(shù)據(jù)基礎之上。
　　3、‘杭白芍’在自然和人工低溫下的需冷量、花期調(diào)控及休眠生理
　　自然低溫下，‘杭白芍’打破芽休眠的最低需冷量為540 CH（cumulative chilling hour）和665 CU

9、(cumulative chilling unit)，最佳需冷量為795 CH和906 CU;在人工給予的冷庫低溫下，則為672 CH和590.69 CU。
　　單純將自然低溫與溫室處理相結合，可以明顯將‘杭白芍’花期提前35-40天;使用5-氮雜胞苷抹芽的催芽和催花效果并不明顯;赤霉素盆灌的催芽效果明顯，但植株總會倒伏和枯萎;在0-4℃的冷庫中處理2周，可將‘杭白芍’花期提前75天左右，而處理4周并結合300 mg/L的腐植酸處

10、理至花期，可將花期提前60天左右，并保證較好的開花效果。在自然低溫下‘杭白芍’的芽休眠過程中，可溶性糖含量上升，淀粉含量下降，IAA/ABA變化不穩(wěn)定，POD活性穩(wěn)步上升;在芽萌發(fā)過程中，可溶性糖含量和POD活性均大幅下降，IAA/ABA則迅猛上升，淀粉含量基本不變，保持在相對較低的水平。
　　4、‘杭白芍’地下芽休眠階段劃分和休眠轉錄組測序
　　‘杭白芍’地下芽經(jīng)歷了5個休眠階段:生理休眠階段、生理與生態(tài)休眠轉化階段、生化

11、休眠階段、生化休眠與芽萌發(fā)轉換階段、芽萌發(fā)階段。利用RNA-seq對休眠和萌發(fā)期間6個階段的‘杭白芍’地下芽進行測序，并通過“Trinity”和“Trinity+PRICE”兩種拼接方法分別獲得207，827和51，481個unigene。在基于第2種方法的基礎上，篩選出了2，057個差異表達基因，并進行了數(shù)量對比、GO功能富集、表達模式和聚類等分析。
　　5、‘杭白芍’地下芽在休眠期間的差異基因表達
　　‘杭白芍’芽休眠過

12、程中的差異表達基因，可以主要劃分為環(huán)境響應相關基因、代謝相關基因和細胞生長發(fā)育相關基因。隨著休眠進程不斷向前推進，與溫度響應相關的suppresspor of overexpression of constans1(SOC1)和late elongated hypocotyl(LHY)基因先上調(diào)后下調(diào)，可能與需冷量、抗寒性和生理節(jié)律相關;光敏色素(phytochrome，PHY)、熱激蛋白（heat shock protein，HSP）

13、和滲透蛋白(osmotin, OSM)基因在芽萌發(fā)階段上調(diào)，可能是受到了顯著變化的光照和溫度因子的誘導，推動‘杭白芍’芽休眠的解除和萌發(fā);水孔蛋白(aquaporin, AQP)、脫水蛋白（dehydrin，DHN）、貝塔淀粉酶（β-amylase）、H+-ATPase、生長素抑制蛋白（auxin-repressed protein，ARP）、赤霉素抑制因子(repressor of GA，RGA)、GA20氧化酶(GA20 oxida

14、se，GA20ox)、乙烯響應元件結合因子(ethylene responsive elementbinding factor, ERF)和過氧化物酶(peroxidase，PER)等因子的相關基因，與水分代謝和物質轉運、碳水化合物和能量代謝、激素代謝和抗氧化代謝相關，在芽休眠過程中表達活躍，推動或抑制了休眠解除;細胞周期蛋白(cyclin，CYC)、膨脹素(expansin，EXP)、組蛋白(histone)、染色質濃縮調(diào)節(jié)因子(re

15、gulator of chromosome condensation1，RCC1)等相關基因調(diào)控細胞周期和細胞分裂，多數(shù)基因的上調(diào)表達與芽長的增長和細胞的分裂是吻合的。差異基因表達的研究結果是基于轉錄組測序獲得的FPKM(the value of fragments perkilobase of exon model per million mapped reads)值，還需要通過其他的分子生物學手段進行驗證，并挖掘更多與休眠相關的重要

16、基因。
　　6、南北芍藥品種間的雜交育種實踐
　　利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride，TTC）、醋酸洋紅(acetocarmine)和碘-碘化鉀(I2-KI)三種染色法和培養(yǎng)基萌發(fā)法觀測‘杭白芍’花粉生活力，平均為55.60％，活力較高。菏澤芍藥品種間的雜交雖然結種，但不能萌發(fā)。由‘杭白芍’作父本參與的雜交組合幾乎都能夠結種和萌發(fā)，雜交苗生長健壯。將華北與浙江芍藥品