中華絨螯蟹螺原體磷脂代謝和精氨酸代謝中幾種關(guān)鍵蛋白的功能研究.pdf

1、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖種類(lèi)，近年來(lái)，隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大和集約化程度的不斷提高，由細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等病原引起的各種病害日益嚴(yán)重，給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。其中顫抖病是中華絨螯蟹中最為嚴(yán)重的病害，王文等的前期研究證明顫抖病的病原為一種特殊的細(xì)菌——螺原體，并正式命名為中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasmaeriocheiris）。S.eriocheiris不僅可以感染其自然

2、界宿主中華絨螯蟹，還可以感染雞胚和新生小鼠，引起小鼠白內(nèi)障的病癥，這與非凡螺原體（Spiroplasma mirum）可以引起嚙齒類(lèi)新生個(gè)體（包括新生小鼠）患白內(nèi)障的病癥非常相似。前期研究對(duì)S.eriocheiris生理生化性質(zhì)、分類(lèi)地位、病原檢測(cè)、敏感藥物的篩選和有效治療藥物的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，以及分別構(gòu)建了中華絨螯蟹螺原體侵染脊椎動(dòng)物小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T6細(xì)胞）模型和侵染無(wú)脊椎動(dòng)物中華絨螯蟹血細(xì)胞模型。但是有關(guān)其分子生物學(xué)和

3、主要蛋白功能方面的研究還處于前期階段。因此，本博士學(xué)位論文在前期中華絨螯蟹螺原體基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用比較基因組學(xué)，篩選和鑒定與中華絨螫蟹螺原體與致病相關(guān)的毒力因子、能量代謝以及侵染機(jī)制相關(guān)蛋白，這些工作為下一步研究中華絨螯蟹螺原體分子水平致病機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　1.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化以及酶活性質(zhì)的分析
　　通過(guò)對(duì)中華絨螯蟹螺原體基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)中

4、華絨螯蟹螺原體中僅含有一種磷脂酶——溶血磷脂酶(Lysophospholipase)并將之命名為SE-LsyoPLA，該序列全長(zhǎng)927 bp，編碼一個(gè)308個(gè)氨基酸的蛋白，預(yù)測(cè)的蛋白分子量和等電點(diǎn)分別是35 kDa和pI9.64。生物信息學(xué)分析，其氨基酸序列含有典型的GXSXG序列，三級(jí)結(jié)構(gòu)中Ser-Asp-His三個(gè)氨基酸組成了催化三聯(lián)體。對(duì)SE-LsyoPL基因進(jìn)行成功克隆，點(diǎn)突變，進(jìn)行原核表達(dá)，蛋白純化。通過(guò)水解對(duì)硝基酚酯類(lèi)p-N

5、P palmitate實(shí)驗(yàn)分析重組蛋白的酶活性，結(jié)果顯示SE-LsyoPL的最適的pH值為7.0左右，最適溫度為30℃;在不同溫度下的熱穩(wěn)定性分析結(jié)果表明，在0-30℃溫度范圍內(nèi)酶活力較為穩(wěn)定，當(dāng)溫度升高至50℃時(shí)，SE-LsyoPL已基本失活，說(shuō)明SE-LsyoPL是一種溫和的、中性的磷脂酶?？疾觳煌饘匐x子對(duì)SE-LsyoPL酶活力的影響，Ca2+和Mn2+對(duì)酶的活性沒(méi)有影響。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)SE-LsyoPL對(duì)于長(zhǎng)鏈脂肪酸的水解能力

6、強(qiáng)，但是對(duì)于短鏈脂肪酸的水解能力弱。
　　2.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析
　　利用已經(jīng)純化的SE-LsyoPL的重組蛋白成功地制備了SE-LsyoPL的多克隆抗體，采用間接EHSA法檢測(cè)抗血清的效價(jià)，SE-LsyoPL抗血清的效價(jià)在1∶70000左右。實(shí)驗(yàn)中利用超高速離心的方法成功的提取了S.eriocheiris膜蛋白，利用Western blotting分析表明，SE-LsyoPL是螺原體的

7、一種膜蛋白。
　　實(shí)驗(yàn)中采用已經(jīng)成熟的S.eriocheiri體外侵染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（3T6細(xì)胞）的模型進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，采用抗體中和實(shí)驗(yàn)封閉S.eriocheiri表面的SE-LsyoPL酶位點(diǎn)來(lái)觀察螺原體侵染能力的變化。土霉素法檢測(cè)表明，當(dāng)SE-LsyoPL抗體濃度為20μg/ml時(shí)，螺原體在前期對(duì)3T6細(xì)胞的侵染率明顯下降，螺原體侵染至48h后抗體中和實(shí)驗(yàn)組與螺原體侵染組中螺原體的侵染率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05);當(dāng)SE

8、-LsyoPL抗體濃度為2μg/ml時(shí)，螺原體的侵染率并沒(méi)有顯著變化。采用流式細(xì)胞技術(shù)，進(jìn)一步分析抗體中和實(shí)驗(yàn)組（SE-LsyoPL抗體濃度為20μg/mL）和螺原體侵染組中細(xì)胞凋亡情況。螺原體侵染48h后，中和實(shí)驗(yàn)組中的早期細(xì)胞凋亡率要明顯低于螺原體侵染組(P＜0.05)，正常細(xì)胞的數(shù)量也明顯的高于螺原體侵染組(P＜0.05)，并且中和實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞形態(tài)較好。采用間接免疫熒光電鏡技術(shù)，觀察螺原體對(duì)3T6細(xì)胞的侵染情況，結(jié)果表明在接種螺原

9、體48h后抗體中和實(shí)驗(yàn)組中螺原體的分布主要成零星的點(diǎn)狀分布，主要在宿主細(xì)胞的胞膜上分布且綠色熒光微弱。而在螺原體侵染組中可以看到大量螺原體侵染到宿主細(xì)胞內(nèi)部并成團(tuán)狀分布，形成包涵體且熒光強(qiáng)度高，表明螺原體的侵染要明顯的高于中和實(shí)驗(yàn)組。研究表明，當(dāng)螺原體表面的SE-LsyoPL酶位點(diǎn)被抗體封閉時(shí)，螺原體的侵染率明顯下降。
　　3.中華絨螯蟹螺原體的生長(zhǎng)特性以及對(duì)精氨酸利用的研究
　　本實(shí)驗(yàn)中首先利用了一種簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基R8-1對(duì)

10、S.eriocheiris生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究，研究表明螺原體能很好生長(zhǎng)于R8-1培養(yǎng)基中，S.eriocheiris的最適生長(zhǎng)溫度為30-32℃，最高生長(zhǎng)溫度約42℃。S.eriocheiris最適pH為7.2-7.6，最低耐受約pH約5.0，最高耐受pH高達(dá)10.0。培養(yǎng)基中添加20 mM/L精氨酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)螺原體的生長(zhǎng)速度要明顯高于沒(méi)有添加精氨酸的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度，繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)，添加精氨酸組的平臺(tái)期的要明顯變長(zhǎng)。高效液相色譜（HPLC）

11、對(duì)螺原體利用精氨酸的情況進(jìn)行分析，在培養(yǎng)的前期螺原體并不能利用精氨酸，而到了平臺(tái)期以后螺原體才能逐漸的開(kāi)始利用精氨酸，并且此時(shí)培養(yǎng)基中瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸兩種氨基酸呈明顯上升趨勢(shì)，說(shuō)明此時(shí)螺原體能夠很好的利用精氨酸作為能源物質(zhì)。
　　4.中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase，ADI)系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能分析
　　通過(guò)基因組學(xué)研究表明，S.eriocheiris基因組

12、中含有一條典型的精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，ADI)系統(tǒng)，并包含完整的基因簇，通過(guò)生物信息學(xué)分析表明ADI系統(tǒng)含有精氨酸脫亞胺酶(ADI)，鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)，精氨酸鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因(AOA)和氨甲酰激酶(CK)四個(gè)酶。首先對(duì)ADI系統(tǒng)中三種關(guān)鍵的蛋白——精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)進(jìn)行基因進(jìn)行克隆、點(diǎn)突變、重組蛋白原核表達(dá)、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。通

13、過(guò)Western blotting分析發(fā)現(xiàn)CK和OTC兩種酶是在S.eriocheiris的細(xì)胞膜上具有分布。在不同pH、不同溫度、培養(yǎng)基中添加精氨酸和不同濃度葡萄糖的條件下，利用RealTime-PCR和Western blotting技術(shù)，從分子層面上研究S.eriocheiris在不同環(huán)境條件下ADI系統(tǒng)關(guān)鍵酶的基因水平和蛋白水平表達(dá)量變化情況，結(jié)果表明ADI系統(tǒng)在高溫和酸性(pH=5)等不良的環(huán)境下，ADI系統(tǒng)中基因的表達(dá)量明顯

14、上調(diào)，蛋白的表達(dá)量顯著升高。但在培養(yǎng)基中高濃度糖類(lèi)時(shí)，ADI系統(tǒng)卻會(huì)被明顯的抑制。綜合結(jié)果表明精氨酸代謝系統(tǒng)在S.eriocheiris能量代謝和抗逆過(guò)程中起到重要的作用。
　　5.中華絨螯蟹螺原體鮮精胺脫亞胺酶（Aatine deiminase,AgDI）系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析及其克隆、表達(dá)純化和功能的分析
　　研究發(fā)現(xiàn)S.eriocheiris基因組中還含有一條完整的鯡精胺脫亞胺(Agmatinedeiminas

15、e，AgDI)系統(tǒng)，基因簇中含有完整的基因包括鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)、胍丁胺-腐胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(A/P)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)。首先對(duì)AgDI系統(tǒng)中兩種關(guān)鍵的蛋白鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(PTC)進(jìn)行基因克隆、點(diǎn)突變、重組蛋白原核表達(dá)、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。利用RealTime-PCR和Western blotting方法從分子層面上研究S.eriocheiris在不同環(huán)境條件下（不同pH環(huán)境、不同溫度

16、及不同濃度葡萄糖條件下）AgDI系統(tǒng)關(guān)鍵酶的基因水平和蛋白水平表達(dá)量變化，結(jié)果表明AgDI系統(tǒng)在酸性(pH=5)不良的環(huán)境下，AgDI系統(tǒng)中基因的表達(dá)量明顯上調(diào)，蛋白的表達(dá)量顯著升高，但是在高溫情況下，AgDI酶的表達(dá)量并沒(méi)有明顯升高，表明AgDI系統(tǒng)在高溫下沒(méi)有被明顯的激活。在當(dāng)培養(yǎng)基中高濃度糖類(lèi)存在的條件下，AgDI系統(tǒng)卻會(huì)被明顯的抑制。結(jié)果表明鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)在S.eriocheiris能量代謝和抵抗pH過(guò)程中起到重要的作用，但