觀賞花煙草(Nicotiana sanderae)VIGS體系構(gòu)建與優(yōu)化.pdf

1、觀賞花煙草（Nicotianasanderae）是茄科煙草屬福吉特氏煙草（Nicotianaforgetiana）和花煙草（Nicotianaalata）的雜交種，花色艷麗且具有香味，十分適合進(jìn)行花色花香基因功能的研究。為了搭建起大規(guī)模驗(yàn)證觀賞花煙草新型花色花香基因功能的技術(shù)平臺，我們利用由煙草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus，TRV）構(gòu)建而來的重組病毒載體，以八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoenedesaturase，PD

2、S)基因和查爾酮合酶(chalconesynthase，CHS)基因?yàn)閳?bào)告基因，進(jìn)行了觀賞花煙草病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)體系的初步構(gòu)建與優(yōu)化，結(jié)果如下:
　　1、以PDS基因作為報(bào)告基因的試驗(yàn)中，用根吸收法侵染觀賞花煙草浸種催芽至0.5～1cm長的幼根，種子點(diǎn)播后成活率均低于30％，且成活的樣本在其整個(gè)生命周期內(nèi)均未出現(xiàn)過葉片光漂白的預(yù)期現(xiàn)象，證明根吸收法并不適用于誘導(dǎo)觀賞

3、花煙草的基因沉默;而常規(guī)播種養(yǎng)護(hù)至觀賞花煙草五葉期或六葉期再使用擴(kuò)大培養(yǎng)濃度為OD600=1.1的農(nóng)桿菌菌液制備侵染液，用葉背注射滲透法（注射器不帶針頭）向最內(nèi)輪葉片葉背打入200～400μl侵染液進(jìn)行葉片侵染，此后將植株置于光照培養(yǎng)箱中，先設(shè)定16h為25℃、8h為18℃在全黑暗條件下培養(yǎng)1天，再設(shè)定光溫周期為光照16h25℃/黑暗8h18℃進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)，25天后處理組中表現(xiàn)出預(yù)期葉片光漂白現(xiàn)象的植株占到80％;
　　2、利用“

4、siRNAScan”篩選出能有效產(chǎn)生21ntsiRNA的CHS基因片段，用不依賴連接的克?。↙igation-Independentcloning，LIC）法構(gòu)建重組病毒載體pTRV2-CHS，檢測陽性率達(dá)100％;
　　3、以CHS基因作為報(bào)告基因的試驗(yàn)中，采用前述VIGS技術(shù)體系進(jìn)行葉片侵染及培養(yǎng)，注射侵染30天后或45天后（此時(shí)已入秋，氣溫不高于28℃）將植株從光照培養(yǎng)箱移至夜間加光3h的溫室大棚中，常規(guī)養(yǎng)護(hù)，植株開花后成功