豬DECR1和GPR81基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、豬肉品質(zhì)作為豬育種工作中的重要經(jīng)濟性狀之一，已經(jīng)成為育種工作者關(guān)注的重點。眾所周知，脂肪性狀是影響豬肉品質(zhì)的重要因素，對其進行深入研究將有助于我們找到改善豬肉品質(zhì)的方法。為此，本試驗對影響脂肪性狀的兩個基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了初步研究，以揭開其轉(zhuǎn)錄調(diào)控原理的面紗，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。本試驗主要從以下幾個方面對DECR1基因和GPR81基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制進行了研究;
　　(1)通過QT-PCR技術(shù)對GPR81基因在大白豬的各個組

2、織表達情況進行定量研究，得出GPR81基因在脂肪、肝臟以及腎臟組織中高表達，其中脂肪組織中表達量最高，其他組織中微量表達或不表達。
　　(2)通過NCBI和EBI數(shù)據(jù)庫查詢得到DECR1、GPR81基因5'端上游大約2000bp的調(diào)控序列，并對其進行PCR克隆，分別獲得2099bp、1798bp的序列。利用生物信息學(xué)技術(shù)分別對這兩個基因的5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進行了預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)DECR1基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)存在AP1、S

3、P1、MZF1等多種常見的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。對CpG島分布情況分析，發(fā)現(xiàn)沒有CpG島存在;在GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)有GATA-1、GATA-2、GATA-X、SRY、AML-1α等高分值轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。同樣，在GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域也沒有發(fā)現(xiàn)CpG島存在。
　　(3)對DECR1、GPR81基因5'端上游序列設(shè)計一系列缺失片段，構(gòu)建各個缺失片段的雙熒光素酶報告基因載體，并分別在C2C12、3T3-

4、L1、PK15細胞中進行雙熒光素酶活性檢測。分別對DECR1基因的DP7缺失片段和GPR81基因的GP7缺失片段進一步構(gòu)建缺失載體，繼續(xù)進行雙熒光活性檢測。
　　(4)對雙熒光活性測定結(jié)果進行分析，并對雙熒光素酶活性差異顯著的缺失片段間的序列進行生物信息學(xué)預(yù)測，找出對啟動子轉(zhuǎn)錄活性起重要調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通過TFSearch軟件對這兩個基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SP1、MZF1轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和GATA1、GATA2、GATAx轉(zhuǎn)錄調(diào)控

5、因子可能分別對DECR1基因和GPR81基因啟動子具有顯著地調(diào)控作用。
　　(5)為了進一步鑒定DECR1和GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，我們對這兩個基因各個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行定點突變，并對DECR1基因的轉(zhuǎn)錄因子SP1和GPR81基因的轉(zhuǎn)錄因子GATA1進行超表達實驗進行驗證，此外對SP1轉(zhuǎn)錄因子進行siRNA干擾試驗驗證。結(jié)果顯示突變后DECR1和GPR81基因5'端上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)