豬APOA2和SEPW1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析.pdf

1、豬，是我們獲取動(dòng)物蛋白質(zhì)的主要來源。豬肉品質(zhì)好壞直接影響著口感。隨著生活水平的提高，人們對(duì)豬肉品質(zhì)的要求也有所提高。因此，通過分子育種的方法改善豬的肉質(zhì)性狀是當(dāng)前比較熱門的一項(xiàng)研究課題。為此，我們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)豬的脂肪相關(guān)基因APOA2和肌肉相關(guān)基因SEPW1進(jìn)行了相關(guān)性研究，主要集中在基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。所得的結(jié)果如下所述:
　　(1)豬APOA2和SEPW1基因在豬不同組織中表達(dá)情況的研究。主要采用實(shí)時(shí)定量PCR

2、的方法進(jìn)行檢測(cè)，并建立了組織表達(dá)譜。結(jié)果為:豬APOA2基因主要在肝臟中表達(dá)，并且表達(dá)量很高;在脂肪中也有微量的表達(dá);在其它組織中表達(dá)量極低，可忽略不計(jì)。豬SEPW1基因在各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá)，而在心臟和腓腸肌組織中表達(dá)量最高，在脾臟中表達(dá)量最低。
　　(2)豬APOA2和SEPW1基因5'側(cè)翼調(diào)控序列的克隆。我們參照NCBI上提供的基因5'側(cè)翼調(diào)控序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，以豬基因組DNA為模板，克隆了豬APOA2基因1919b

3、p和SEPW1基因1993bp的序列。序列克隆結(jié)果與NCBI上提供的序列進(jìn)行比對(duì)，相似度均達(dá)到99％。
　　(3)豬SEPW1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化情況研究。通過MethPrimer軟件預(yù)測(cè)豬APOA2和SEPW1基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，在APOA2基因啟動(dòng)子序列中沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，而SEPW1基因啟動(dòng)子序列中有3個(gè)CpG島。對(duì)位于SEPW1基因啟動(dòng)子的-751～-483區(qū)域的CpG島進(jìn)行了克隆分析，甲基化水平均較低。

4、　　(4)啟動(dòng)子活性研究。我們構(gòu)建了APOA2基因啟動(dòng)子區(qū)域的7個(gè)不同長(zhǎng)度的雙熒光素酶報(bào)告基因載體，以及SEPW1基因啟動(dòng)子區(qū)域的6個(gè)不同長(zhǎng)度的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光活性，發(fā)現(xiàn)APOA2基因啟動(dòng)子的-208～-21、-813～-209這兩個(gè)區(qū)域分別能夠獨(dú)立起始轉(zhuǎn)錄，SEPW1基因核心啟動(dòng)子位于-443～+27區(qū)域內(nèi)。
　　(5)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的分析預(yù)測(cè)。我們對(duì)可能含有正調(diào)控元件的區(qū)域繼續(xù)進(jìn)行缺失分析，并結(jié)合生

5、物信息學(xué)方法，得出在APOA2基因-601～-565區(qū)域內(nèi)含有GATA1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在SEPW1基因-378～-306區(qū)域內(nèi)含有SP1結(jié)合位點(diǎn)。
　　(6)我們突變了GATA1結(jié)合位點(diǎn)的3個(gè)堿基，轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)突變后的片段活性顯著低于未突變片段的活性;轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞時(shí)，突變后的片段與原片段相比，活性極顯著降低。對(duì)于SP1的結(jié)合位點(diǎn)，我們突變了單個(gè)堿基，轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)突變載體的活性極顯著降低。
　　(7)分別